(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111455010 A(43)申请公布日 2020.07.28
(21)申请号 202010324398.X(22)申请日 2020.04.22
(71)申请人 广东丸美生物技术股份有限公司
地址 510000 广东省广州市高新技术产业
开发区科学城伴河路92号2号楼(72)发明人 郭朝万 宫村公纪 旷小珊
聂艳峰 (74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务
所(特殊普通合伙) 11463
代理人 刘桐亚(51)Int.Cl.
C12P 21/06(2006.01)C07K 14/435(2006.01)C07K 1/12(2006.01)C07K 1/34(2006.01)
权利要求书2页 说明书13页 附图2页
C07K 1/14(2006.01)A61K 8/64(2006.01)A61Q 19/02(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
CN 111455010 A(54)发明名称
珍珠蛋白及其制备方法和应用以及包含其的化妆品(57)摘要
本发明提供了一种珍珠蛋白及其制备方法和应用以及包含其的化妆品，涉及珍珠产品深加工技术领域，该制备方法包括以下步骤：(a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；(b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；(c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行固液分离和脱盐处理，得到珍珠蛋白。上述制备方法采用蛋白酶和乳酸依次对含有珍珠粉的水悬浮液进行水解的方法制备珍珠蛋白，其所制得的珍珠蛋白更容易被皮肤吸收。同时本发明制备方法通过采用过滤和脱盐的方法对水解液B进行处理后，也不存在有机溶剂残留的问题，十分适应于工业化大规模生产。
CN 111455010 A
权 利 要 求 书
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1.一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；
(b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；(c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行固液分离和脱盐处理，得到珍珠蛋白。2.根据权利要求1所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)水悬浮液中珍珠粉与水的料液比为1～2：30g/ml，优选为1.5:30g/ml；
优选地，所述珍珠粉的粒径为5～20μm，优选为10μm；优选地，所述步骤(a)水悬浮液的制备方法包括以下步骤：将珍珠粉加水混匀后，升温至100～120℃处理15～20min，随后冷却至40～45℃，得到水悬浮液。
3.根据权利要求1所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40～45℃，时间为4～8h；
优选地，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40℃，时间为6h；优选地，所述蛋白酶为中性蛋白酶；优选地，所述步骤(a)中蛋白酶的加入量为：每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶；更优选地，所述蛋白酶分两次加入，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。
4.根据权利要求3所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的方法包括以下步骤：
在40～45℃的条件下，在水悬浮液中加入中性蛋白酶进行水解4～8小时，得到水解液A，所述中性蛋白酶的加入量为：每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶；
优选地，所述中性蛋白酶分两次加入水悬浮液中进行水解，每次2～4h，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。
5.根据权利要求1所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95～100℃，时间为2～2.5h；
优选地，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95℃，时间为2h；优选地，所述乳酸为浓度85～90wt％的乳酸溶液；优选地，所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸；优选地，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的方法包括以下步骤：在95～100℃的条件下，将水解液A在乳酸的作用下进行水解2～2.5h，得到水解液B；所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸。
6.根据权利要求1所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)过滤为布氏漏斗抽滤；
优选地，所述步骤(c)脱盐为透析脱盐；更优选地，所述透析脱盐的方法为：2～4℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋进行透析除盐3～4天。
7.根据权利要求1所述的珍珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(d)：对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理的步骤；
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权 利 要 求 书
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优选地，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为2～8Pa，温度为-90～-60℃，时间为60～72h；
更优选地，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
8.一种珍珠蛋白，其特征在于，所述珍珠蛋白由上述权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.一种根据权利要求8所述的珍珠蛋白在制备化妆品中的应用。10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包括权利要求9所述的珍珠蛋白。
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说 明 书
珍珠蛋白及其制备方法和应用以及包含其的化妆品
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技术领域
[0001]本发明涉及珍珠产品深加工技术领域，尤其是涉及一种珍珠蛋白及其制备方法和应用以及包含其的化妆品。
背景技术
[0002]贝壳硬蛋白(Conchiolin protein)是一类水产物中特有的硬蛋白，经常与贝壳中的钙紧密连接在一起，形成已有光泽的珍珠层。将这珍珠层进行水解，即为水解贝壳硬蛋白(Hydrolyzed conchiolin protein)。水解贝壳硬蛋白也经常以具体的材料命名，如水解珍珠蛋白、水解牡蛎蛋白等。
[0003]珍珠是一种古老的有机宝石，主要产于珍珠贝类和珠母贝类软体动物体内，一直以来珍珠都被人们视为名贵珍品，其不仅是女性贵重的装饰品，同时也是珍贵的美容品和药材。《本草纲目》中早有记载，珍珠具有清热解毒、护肝明目、镇静安神等作用；现代医学也证明珍珠具有很好的提高超氧化物歧化酶活性和增强皮肤功能的效果。因此，随着近年来人们生活水平的提高，含珍珠成分的美白护肤产品越来越受到人们的喜爱。[0004]然而，现有珍珠产品的深加工研究并不充分，美白护肤产品中的珍珠成分往往是利用较为粗放的水解方法制得，例如使用一些强酸性物质进行水解，其得到的产品往往不利于皮肤的吸收，而且渗透性也不好，美白抗衰老效果并不理想；同时这些利用强酸等物质进行分解后的珍珠成分，还会存在有机溶剂残留的问题，也容易给环境造成影响。[0005]因此，研究开发出一种利于皮肤吸收、渗透性好，具有很好的美白抗衰老功能的珍珠蛋白，变得十分必要和迫切。[0006]有鉴于此，特提出本发明。发明内容
[0007]本发明的第一目的在于提供一种珍珠蛋白的制备方法，该制备方法采用蛋白酶和乳酸依次对含有珍珠粉的水悬浮液进行水解的方法制备珍珠蛋白，更有利于珍珠中的有效成分溶出，同时对环境友好，十分适应于工业化大规模生产。[0008]本发明的第二目的在于提供一种珍珠蛋白，该珍珠蛋白相对于现有珍珠提取蛋白具有利于皮肤吸收、渗透性好的优势，同时经试验验证具有很好的美白抗衰老功能。[0009]本发明的第三目的在于提供一种上述珍珠蛋白的应用，该珍珠蛋白可以广泛应用于化妆品的制备过程中。
[0010]本发明的第四目的在于提供一种化妆品，所述化妆品包含上述珍珠蛋白。[0011]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：[0012]本发明提供的一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0013](a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；[0014](b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；
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说 明 书
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(c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行固液分离和脱盐处理，得到珍珠蛋白。
[0016]进一步的，所述步骤(a)水悬浮液中珍珠粉与水的料液比为1～2：30g/ml，优选为1.5:30g/ml；[0017]优选地，所述珍珠粉的粒径为5～20μm，优选为10μm。[0018]优选地，所述步骤(a)水悬浮液的制备方法包括以下步骤：[0019]将珍珠粉加水混匀后，升温至100～120℃处理15～20min，随后冷却至40～45℃，得到水悬浮液。
[0020]进一步的，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40～45℃，时间为4～8h；
[0021]优选地，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40℃，时间为6h；[0022]优选地，所述蛋白酶为中性蛋白酶。[0023]优选地，所述步骤(a)中蛋白酶的加入量为：每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶；
[0024]更优选地，所述蛋白酶分两次加入，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。[0025]更进一步的，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的方法包括以下步骤：[0026]在40～45℃的条件下，水悬浮液中加入中性蛋白酶进行水解4～8小时，得到水解液A，所述中性蛋白酶的加入量为：每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶；[0027]优选地，所述中性蛋白酶分两次加入水悬浮液中进行水解，每次2～4h，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。
[0028]进一步的，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95～100℃，时间为2～2.5h；
[0029]优选地，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95℃，时间为2h；[0030]优选地，所述乳酸为浓度85～90wt％的乳酸溶液。[0031]优选地，所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸。[0032]更进一步的，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的方法包括以下步骤：[0033]在95～100℃的条件下，将水解液A在乳酸的作用下进行水解2～2.5h，得到水解液B；所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸。[0034]进一步的，所述步骤(c)过滤为布氏漏斗抽滤；[0035]进一步的，所述步骤(c)脱盐为透析脱盐；[0036]优选地，所述透析脱盐的方法为：2～4℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋进行透析除盐3～4天。[0037]进一步的，所述制备方法还包括步骤(d)：对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理的步骤；
[0038]优选地，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为2～8Pa，温度为-90～-60℃，时间为60～72h；[0039]更优选地，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
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说 明 书
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本发明提供的一种珍珠蛋白，所述珍珠蛋白由上述制备方法制备得到。
[0041]本发明提供的一种珍珠蛋白在制备化妆品中的应用。[0042]本发明提供的一种化妆品，所述化妆品包括上述珍珠蛋白。[0043]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0044]本发明提供的珍珠蛋白的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；(b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；(c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行过滤和脱盐处理，得到珍珠蛋白。上述制备方法采用蛋白酶和乳酸依次对含有珍珠粉的水悬浮液进行水解的方法制备珍珠蛋白，其中先用蛋白酶水解，离子干扰少，可以在温和的条件下使蛋白酶充分发挥其水解功效，产生游离的蛋白质，然后利用乳酸将珍珠粉中不溶于水的碳酸钙转化成能被人体直接吸收利用的活性钙及微量元素，进一步将酶解后的游离蛋白质酸解成分子量较小的水溶性蛋白、多肽、氨基酸等，采取酶-酸水解的方法工艺流程简单，减少反应时间，提高提取效率，成本低，更有利于珍珠中的有效成分溶出，水解更为彻底，制得的珍珠蛋白更容易被皮肤吸收，具有良好的渗透性。同时本发明制备方法通过采用过滤和脱盐的方法对水解液B进行处理后，也不存在有机溶剂残留的问题，对环境友好，十分适应于工业化大规模生产。
[0045]本发明提供的珍珠蛋白相对于现有珍珠提取蛋白具有利于皮肤吸收、渗透性好的优势，同时经试验验证具有很好的美白抗衰老功能。
[0046]本发明提供的珍珠蛋白可以广泛应用于化妆品的制备过程中。[0047]本发明提供的化妆品，该化妆品包括上述珍珠蛋白，上述化妆品具有很好的美白抗衰老的功能。
附图说明
[0048]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0049]图1为本发明实验例4提供的实施例5制得的不同浓度的珍珠蛋白对DPPH清除能力的检测图；
[0050]图2为本发明实验例4提供的对照组不同浓度的维生素C对DPPH清除能力的检测图；
[0051]图3为本发明实验例5提供的实施例5制得的不同浓度的珍珠蛋白对ABTS+·清除能力的检测图；
[0052]图4为本发明实验例5提供的对照组不同浓度的维生素C对ABTS+·清除能力的检测图。
具体实施方式
[0053]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
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说 明 书
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术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0054]根据本发明的一个方面，一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0055](a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；[0056](b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；[0057](c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行固液分离和脱盐处理，得到珍珠蛋白。[0058]本发明提供的珍珠蛋白的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(a)、提供含有珍珠粉的水悬浮液，然后在蛋白酶的作用下对水悬浮液进行水解，得到水解液A；(b)、将步骤(a)得到的水解液A在乳酸的作用下进行水解，得到水解液B；(c)、将步骤(b)得到的水解液B依次进行过滤和脱盐处理，得到珍珠蛋白。上述制备方法采用蛋白酶和乳酸依次对含有珍珠粉的水悬浮液进行水解的方法制备珍珠蛋白，其中先用蛋白酶水解，离子干扰少，可以在温和的条件下使蛋白酶充分发挥其水解功效，产生游离的蛋白质，然后利用乳酸将珍珠粉中不溶于水的碳酸钙转化成能被人体直接吸收利用的活性钙及微量元素，进一步将酶解后的游离蛋白质酸解成分子量较小的水溶性蛋白、多肽、氨基酸等，采取酶-酸水解的方法工艺流程简单，减少反应时间，提高提取效率，成本低，这样更有利于珍珠中的有效成分溶出，制得的珍珠蛋白更容易被皮肤吸收，具有良好的渗透性。同时本发明制备方法通过采用过滤和脱盐的方法对水解液B进行处理后，也不存在有机溶剂残留的问题，对环境友好，十分适应于工业化大规模生产。
[0059]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)水悬浮液中珍珠粉与水的料液比为1～2：30g/ml，优选为1.5:30g/ml；[0060]作为一种优选的实施方式，上述水悬浮液中珍珠粉与水的料液比1.5:30g/ml。[0061]在上述优选实施方式中，所述珍珠粉的粒径为5～20μm，优选为10μm。[0062]作为一种优选的实施方式，上述珍珠粉的粒径为5～20μm，微米级的珍珠粉粒径更有利于珍珠中的有效成分在提取的过程中溶出。
[0063]上述珍珠粉的粒径典型但非限制性的优选实施方案为：5μm、8μm、10μm、12μm、15μm、18μm和20μm。
[0064]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)水悬浮液的制备方法包括以下步骤：将珍珠粉加水混匀后，升温至100～120℃处理15～20min，随后冷却至40～45℃，得到水悬浮液。
[0065]作为一种优选的实施方式，上述煮沸的方法是为了使珍珠粉水悬浮液达到澎润的目的，这样更有利于后期的提取。
[0066]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40～45℃，时间为4～8h；
[0067]作为一种优选的实施方式，上述在蛋白酶的作用下进行水解的温度和时间40℃和6h。
[0068]上述在蛋白酶的作用下进行水解的温度典型但非限制性的优选实施方案为：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃和45℃；上述在蛋白酶的作用下进行水解的时间典型但非限制性的优选实施方案为：4h、5h、6h、7h和8h。
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优选地，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的温度为40℃，时间为6h；
[0070]在本发明的一种优选实施方式中，所述蛋白酶为中性蛋白酶。[0071]在上述优选实施方式中，所述蛋白酶分两次加入，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。[0072]作为一种优选的实施方式，上述蛋白酶分两次加入，便于控制酶的添加量，使酶量达到最佳值，满足水解完全的同时，且方便后续处理所添加的酶，控制经济成本。[0073]在上述优选实施方式中，所述步骤(a)在蛋白酶的作用下进行水解的方法包括以下步骤：
[0074]在40～45℃的条件下，水悬浮液中加入中性蛋白酶进行水解4～8小时，得到水解液A，所述中性蛋白酶的加入量为：每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶；[0075]优选地，所述中性蛋白酶分两次加入进行水解，每次2～4h，其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25，优选为0.1:0.05。[0076]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95～100℃，时间为2～2.5h；
[0077]作为一种优选的实施方式，上述在乳酸的作用下进行水解的温度和时间为95℃和2h。
[0078]上述在乳酸的作用下进行水解的温度典型但非限制性的优选实施方案为：95℃、96℃、97℃、98℃、99℃和100℃；上述在乳酸的作用下进行水解的时间典型但非限制性的优选实施方案为：2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h和2.5h。[0079]优选地，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的温度为95℃，时间为2h；[0080]优选地，所述乳酸为浓度85～90％的乳酸溶液。[0081]在本发明的一种优选实施方式中，所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸，1.5g珍珠粉中加入4mL乳酸的效果最佳。[0082]在上述优选实施方式中，所述步骤(b)在乳酸的作用下进行水解的方法包括以下步骤：
[0083]在95～100℃的条件下，将水解液A在乳酸的作用下进行水解2～2.5h，得到水解液B；所述乳酸的加入量为：每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸。[0084]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)过滤为布氏漏斗抽滤；[0085]优选地，所述布氏漏斗的规格为200～300mm，优选为250mm。[0086]在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)脱盐为透析脱盐；[0087]优选地，所述透析脱盐的方法为：2～4℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋进行透析除盐3～4天。
[0088]在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法还包括步骤(d)：对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理的步骤；[0089]作为一种优选的实施方式，所述冻干处理可以更大程度的保留珍珠蛋白中的有效成分，避免高温脱水带来的有效成分流失的问题。[0090]在上述优选实施方式中，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为2～8Pa，温度为-90～-60℃，时间为60～72h；[0091]优选地，所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空
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度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。[0092]优选地，所述制备方法包括以下步骤：[0093](a)、将粒径为5～20μm的珍珠粉以1～2：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理15～20min，随后冷却至40～45℃，得到水悬浮液；[0094]随后，在40～45℃的条件下，以每1～2g珍珠粉加入0.15～0.75g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次2～4h，得到水解液A；
[0095]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1～0.5：0.05～0.25；[0096](b)、将水解液A的温度升高至95～100℃，以每1～2g珍珠粉加入2～4.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2～2.5h，得到水解液B；[0097](c)、使用规格为200～300mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在2～4℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐3～4天，得到珍珠蛋白；[0098](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0099]根据本发明的一个方面，一种珍珠蛋白，所述珍珠蛋白由上述制备方法制备得到。[0100]本发明提供的珍珠蛋白相对于现有珍珠提取蛋白具有利于皮肤吸收、渗透性好的优势，同时经试验验证具有很好的美白抗衰老功能。[0101]根据本发明的一个方面，一种珍珠蛋白在制备美白抗衰老产品中的应用。[0102]本发明提供的珍珠蛋白可以广泛应用于化妆品的制备过程中。[0103]根据本发明的一个方面，一种化妆品，所述化妆品包括上述珍珠蛋白。[0104]下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。[0105]实施例1
[0106]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0107](a)、将粒径为5μm的珍珠粉以1：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理15min，随后冷却至40℃，得到水悬浮液；[0108]随后，在40℃的条件下，以每1g珍珠粉加入0.15g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次2～4h，得到水解液A；
[0109]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1：0.05；[0110](b)、将水解液A的温度升高至95℃，以每1g珍珠粉加入2ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2h，得到水解液B；[0111](c)、使用规格为200mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在2℃的条件下，用0.8KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐3天，得到珍珠蛋白；[0112](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0113]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为2Pa，温度为-90℃，时间为60h。[0114]实施例2
[0115]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0116](a)、将粒径为20μm的珍珠粉以2：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理20min，随后冷却至45℃，得到水悬浮液；[0117]随后，在45℃的条件下，以每2g珍珠粉加入0.75g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分
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两次加入中性蛋白酶进行水解，每次4h，得到水解液A；
[0118]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.5：0.25；[0119](b)、将水解液A的温度升高至100℃，以每2g珍珠粉加入4.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2.5h，得到水解液B；[0120](c)、使用规格为300mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在4℃的条件下，用1KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0121](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0122]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为8Pa，温度为-60℃，时间为72h。[0123]实施例3
[0124]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0125](a)、将粒径为7μm的珍珠粉以1.2：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理16min，随后冷却至42℃，得到水悬浮液；[0126]随后，在42℃的条件下，以每1.4g珍珠粉加入0.5g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次3h，得到水解液A；
[0127]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.4：0.1；[0128](b)、将水解液A的温度升高至97℃，以每1.3g珍珠粉加入2.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2.5h，得到水解液B；[0129](c)、使用规格为200mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在3℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐3.5天，得到珍珠蛋白；[0130](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0131]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为5Pa，温度为-70℃，时间为65h。[0132]实施例4
[0133]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0134](a)、将粒径为18μm的珍珠粉以2：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理19min，随后冷却至44℃，得到水悬浮液；[0135]随后，在44℃的条件下，以每1.8g珍珠粉加入0.6g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次3.5h，得到水解液A；
[0136]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.5：0.1；[0137](b)、将水解液A的温度升高至99℃，以每1.8g珍珠粉加入4ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2.5h，得到水解液B；[0138](c)、使用规格为300mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在3℃的条件下，用0.8～1KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0139](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0140]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为4Pa，温度为-80℃，时间为70h。[0141]实施例5
[0142]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
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CN 111455010 A[0143]
说 明 书
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(a)、将粒径为10μm的珍珠粉以1.5：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理18min，
随后冷却至42℃，得到水悬浮液；[0144]随后，在40℃的条件下，以每1.5g珍珠粉加入0.15g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次3h，得到水解液A；
[0145]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1：0.05；[0146](b)、将水解液A的温度升高至95℃，以每2g珍珠粉加入3.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2h，得到水解液B；[0147](c)、使用规格为250mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在4℃的条件下，用0.9KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0148](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0149]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。[0150]对比例1
[0151]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0152](a)、将粒径为10μm的珍珠粉以1.5：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理18min，随后冷却至42℃，得到水悬浮液；[0153]随后，在40℃的条件下，以每1.5g珍珠粉加入0.15g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次3h，得到水解液A；
[0154]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1：0.05；[0155](b)、使用规格为250mm的布氏漏斗对水解液A进行抽滤，随后在4℃的条件下，用0.9KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0156](c)、对步骤(b)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0157]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
[0158]本对比例与实施例5的不同之处在于，不包括将水解液A在乳酸的作用下进行水解的步骤。
[0159]对比例2
[0160]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0161](a)、将粒径为10μm的珍珠粉以1.5：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理18min，随后冷却至42℃，得到水悬浮液；[0162](b)、将水悬浮液的温度升高至95℃，以每2g珍珠粉加入3.5ml乳酸的比例，在水悬浮液中加入乳酸进行水解2h，得到水解液；[0163](c)、使用规格为250mm的布氏漏斗对水解液进行抽滤，随后在4℃的条件下，用0.9KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0164](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0165]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
[0166]本对比例与实施例5的不同之处在于，本对比例步骤(a)中不包括在中性蛋白酶的作用下进行水解的步骤。
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CN 111455010 A[0167]
说 明 书
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对比例3
[0168]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0169](a)、将粒径为10μm的珍珠粉以1.5：30g/ml的料液比加水混匀后煮沸处理18min，随后冷却至42℃，得到水悬浮液；[0170]随后，在40℃的条件下，以每1.5g珍珠粉加入0.15g蛋白酶的比例，在水悬浮液中加入中性蛋白酶进行水解8h，得到水解液A；[0171](b)、将水解液A的温度升高至95℃，以每2g珍珠粉加入3.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2h，得到水解液B；[0172](c)、使用规格为250mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在4℃的条件下，用0.9KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0173](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0174]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
[0175]本对比例与实施例5的不同之处在于，本对比例步骤(a)的中性蛋白酶为一次加入。
[0176]对比例4
[0177]一种珍珠蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0178](a)、将粒径为10μm的珍珠粉以1.5：30g/ml的料液比加水混匀，得到水悬浮液，随后在40℃的条件下，以每1.5g珍珠粉加入0.15g蛋白酶的比例，在水悬浮液中分两次加入中性蛋白酶进行水解，每次3h，得到水解液A；
[0179]其中第一次加入的蛋白酶与第二次加入的蛋白酶的质量比为0.1：0.05；[0180](b)、将水解液A的温度升高至95℃，以每2g珍珠粉加入3.5ml乳酸的比例，在水解液A中加入乳酸进行水解2h，得到水解液B；[0181](c)、使用规格为250mm的布氏漏斗对水解液B进行抽滤，随后在4℃的条件下，用0.9KD分子量的透析袋对抽滤后的滤液进行透析除盐4天，得到珍珠蛋白；[0182](d)、对步骤(c)得到的珍珠蛋白进行冻干处理，得到珍珠蛋白干粉；[0183]所述冻干处理的处理条件至少满足如下中的至少一个：冻干处理的真空度为3Pa，温度为-90℃，时间为72h。
[0184]本对比例与实施例5的不同之处在于，本对比例步骤(a)中不包括对的含珍珠粉的水悬浮液进行煮沸的步骤。[0185]实验例1
[0186]为表明本申请制备得到的珍珠蛋白具有很好的美白功效，现特使用实施例1～5以及对比例1～4制备得到的珍珠蛋白进行酪氨酸酶活性抑制性能的检测，具体如下：[0187]1、实验原理：
[0188]酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成。因此，可以通过测定美白剂对酪氨酸酶的抑制结果来评价其美白功效。[0189]2、酪氨酸酶试剂配制[0190](1)PBS(pH＝6.8，0.2N)：准确称取17.55g磷酸氢二钠以及7.96g磷酸二氢钠，用水
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CN 111455010 A
说 明 书
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定容至500mL；[0191](2)1.5mmol/L的L-酪氨酸：准确称取0.0272gL-酪氨酸，用PBS分散，定容至100mL；[0192]酪氨酸酶溶液：用PBS溶解酪氨酸酶，使酪氨酸酶的酶活为3000～4000U/mL；[0193]α-熊果苷溶液：用PBS溶解，使其浓度为1mg/mL、0.1mg/mL。[0194]3、实验步骤[0195]吸取1mL L-酪氨酸溶液、0.1mL珍珠水解蛋白溶液、1.8mL PBS溶液于具塞试管中，混匀，25℃水浴10min；加入0.1mL酪氨酸酶溶液，混匀，立即测定其在475nm处吸光值，分别读取30s以及60s时的吸光值。以样品溶剂作为空白，以α-熊果苷溶液作为阳性对照，每个样品测定三个平行样。[0196]4、数据处理
[0197][0198]
按照下式计算样品对酪氨酸酶的抑制率，结果以均值±标准差表示。
其中，A：空白对照组中60s与30s吸光值之差；[0200]B：样品组中60s与30s吸光值之差。[0201]5、实验结果：
[0202]本发明实施例1～5以及对比例1～4制备得到的珍珠蛋白酪氨酸酶活性抑制性能的检测的检测结果如下表所示：
[0199]
[0203]
[0204]
由上表可知，实施例的酪氨酸酶活性抑制率均高于对比例，本申请实施例1～5制
备得到的珍珠水解蛋白的酪氨酸酶活抑制率，与1.25mg/mL的熊果苷的酪氨酸酶活性抑制作用相当。
[0205]实验例3
[0206]本实验例采用FRAP法对实施例1～5以及对比例1～4制备得到的珍珠蛋白进行抗氧化能力的检测，具体如下：[0207]1、实验原理：
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CN 111455010 A[0208]
说 明 书
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FRAP法(Ferric reducing antioxidant potential Assay)可以对各种体液、细
胞或组织裂解液、植物抽提液的总抗氧化能力进行检测。其原理是在酸性条件下Fe3+-吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)可以被样品中还原物质还原为产生蓝色的Fe2+-TPTZ，该化合物在593nm处有最大吸收，根据吸光值大小可以计算出样品的抗氧化活性。[0209]反应式如下：Fe3+-TPTZ(橘黄色)+还原物质→Fe2+-TPTZ(蓝色)[0210]2、试剂配制
[0211]①0.3mol/L醋酸盐缓冲液(pH＝3.6)：1.55g无水乙酸钠用水溶解，加入8mL冰乙酸，用水定容至500mL；
[0212]②0.04mol/L的HCl：0.83mL浓盐酸，稀释至250mL；[0213]③10mmol/L的TPTZ：0.0312gTPTZ溶于10mL的0.04mol/L的HCl溶液；[0214]④20mmol/L的FeCl3溶液：0.2703g FeCl3·6H2O用水溶解并定容至50mL；[0215]⑤1mmol/L的FeSO4·7H2O溶液：0.0139g FeSO4·7H2O用水溶解并定容至50mL；[0216]⑥TPTZ工作液：①：③：④＝10:1:1(现用现配)。[0217]3、实验步骤
[0218]取0.1mL样品溶液于试管中，加入3mL的TPTZ工作液，再加入0.3mL蒸馏水，混匀后37℃保温5min，测定593nm处的吸光值。以蒸馏水调零，分别考查样品溶液、阳性对照(VC或Trolox)、空白对照组的吸光值，每组测定三次。[0219]4、标准曲线的绘制
[0220]将1mmol/L的FeSO4溶液稀释为0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L的标准梯度溶液，分别吸取0.1mL按照上述实验步骤进行测定，绘制吸光值与浓度之间的回归曲线。[0221]参考标曲：Y＝0.950X+0.151，R2＝0.999；(更换试剂后需重新做标曲)[0222]线性范围：0.1～0.8mmol/L FeSO4。[0223]样品的总抗氧化能力以FRAP值表示，1FRAP单位＝1mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol/L数。[0224]5、具体检测结果如下表所示：
[0225]
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CN 111455010 A[0226]
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由上表可知，实施例的蛋白提取率均高于对比例，本申请实施例1～5制备得到的
珍珠水解蛋白具有较强的抗氧化能力，并且随着蛋白浓度的增加抗氧化能力有所提升。[0227]实验例4
[0228]本实验例采用DPPH清除能力的测定，对实施例5制备得到的珍珠蛋白进行抗氧化能力的检测，具体如下：[0229]1、实验原理：
[0230]DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。[0231]2、实验方法：
[0232]配制0.2mmol/L的DPPH·甲醇(或无水乙醇)溶液；配制200mg/mL浓度的待测样品溶液；以VC作为阳性对照样品。
[0233]分别吸取2mL样品溶液和2mL DPPH溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A1；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A2；分别吸取2mLDPPH·溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A0；每个样品做3个平行样。
[0234]
3、实验结果：
[0236]具体实验结果参见图1和图2，由图1和图2可知，本发明实施例5制备得到的珍珠蛋白的DPPH清除率呈剂量依赖关系，也表明本发明珍珠蛋白具有清除DPPH自由基的效果，本申请在4mg/ml的珍珠蛋白浓度下，DPPH的清除率在90％以上，与6～8μg/ml的维生素C相当。[0237]实验例5
[0238]本实验例采用ABTS+·清除能力的测定，对实施例5制备得到的珍珠蛋白进行抗氧化能力的检测，具体如下：[0239]1、实验原理：
[0240]ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+·的产生会被抑制，在734nm测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。Trolox是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参考。[0241]2、试剂配制
[0242]①2.45mmol/L过硫酸钾：0.662g过硫酸钾，用水定容至1000mL；[0243]②7mmol/L的ABTS储备液：0.192gABTS用2.45mmol/L的过硫酸钾定容至50mL，室温避光保存12～16h后使用，可稳定3～4天；[0244]③0.2mmol/L的PBS(pH＝7.4)：19mL 0.2M的磷酸二氢钠溶液与81mL0.2M的磷酸氢二钠溶液混合，即得；
[0245]④10mmol/L的PBS(pH＝7.4)：取50mL的0.2mmol/L的PBS(pH＝7.4)，用水稀释至
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[0235]
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1000mL，即得；
[0246]⑤阳性对照储备液：2.5mmol/L的Trolox乙醇溶液或5mmol/L的Trolox PBS溶液；[0247]⑥供试样品溶液：非水溶的用无水乙醇或三氯甲烷溶解，水溶的用水溶解。[0248]3、实验步骤
[0249]取ABTS储备液，用无水乙醇或10mmol/L的PBS(pH＝7.4)稀释40～50倍，使其在734nm处吸光值为0.7±0.02(30℃)，得到ABTS工作液；[0250]样品测定：吸取6mLABTS工作液，加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值；[0251]样品空白：吸取6mL无水乙醇或PBS缓冲液，加入加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值；[0252]试剂空白：吸取6mLABTS工作液，加入60μL无水乙醇或PBS缓冲液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值；每组实验平行进行三次，实验结果可以直接计算ABTS清除率。
[0253]
4、实验结果
[0255]具体实验结果参见图3和图4，由图3和图4可知，本发明实施例5制备得到的珍珠蛋白的ABTS清除率呈剂量依赖关系，也表明本发明珍珠蛋白具有清除ABTS自由基的效果，本申请在8mg/ml的珍珠蛋白浓度下，ABTS自由基的清除率在90％以上，与0.4～0.6μg/ml的维生素C相当。
[0256]综上所述，制备方法采用蛋白酶和乳酸依次对含有珍珠粉的水悬浮液进行水解的方法制备珍珠蛋白，其所制得的珍珠蛋白更容易被皮肤吸收，具有良好的渗透性。同时对环境友好，十分适应于工业化大规模生产。[0257]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
[0254]
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说 明 书 附 图
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图1
图2
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说 明 书 附 图
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图3
图4
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