・２７０６・史堡塞墅处型苤圭！！！！生！！旦箜！！鲞箜！！塑堡！也』垦狸！！！ｇ：望！！！塑！塑！！！！：！尘：！！：堕！：！！微小ＲＮＡ一３２通过抑制Ｋｒｕｐｐｅｌ样因子４表达促进胃癌细胞的增殖与侵袭魏凯王辉张涛程勇作者单位：４３００１４武汉，华中科技大学附属武汉市ｑ－心医院胃肠痔瘘外科通信作者：王辉，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕｉａｎｄｙ＠１６３．ｃｏｒｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．１２．０２５【摘要】目的观察微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ）一３２对胃癌细胞增殖及侵袭的影响，探讨其调控机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应（ＦＱ—ＰＣＲ）测定ｍｉＲ组、ｌｅｎｔ．ｓｈｍｉＲ一３２组和ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００和慢病毒分别转染ｍｉＲ一３２ｍｉｍｉｃｓ、ｓｃｒａｍｂｌｅ、ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２和ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ．通过ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ实时细胞分析系统测定４组细胞增殖能力，通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验测定４组细胞的侵袭能力，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定Ｋｒｕｐｐｅｌ样凶子４（ＫＩ。Ｆ４）的表达。结果ＦＱ—ＰＣＲ结果显示，ｍｉＲ一３２的表达量在５种胃癌细胞株（ＡＧＳ、ＫＡＴＯ—ｍ、ＭＧＣ８－０３、ＮＣＩ—Ｎ８７、ＳＧＣ一７９０１）中均显著高表达于胃正常组织细胞株ＧＥＳ一１，分别为０．１８±０．０３比１２．４０４－１．４０、０．１８±０．０３比３５．８０±２．１０、０．１８±０．０３比２７．１０±３．６０、０．１８±０．０３比６．２０±１．６０、０．１８±０．０３比８．５０±３．５０，Ｐ＜０．０１；与ｓｃｒａｍｂｌｅ组比较，ｍｉＲ．３２过表达组的细胞数在４８、７２ｈ培养后出现显著增加，４８ｈ时，ｍｉＲ．３２过表达组与ｓｃｒａｍｂｌｅ组相对细胞数为（１６０．３±５．４）％比（１０４．２±３．８）％，Ｐ＜０．０１；７２ｈ时，ｍｉＲ一３２过表达组与ｓｃｒａｍｂｌｅ组相对细胞数为（３１０．２４－５．４）％比（１０７．２４－２．９）％，Ｐ＜０．叭；ｍｉＲ一３２过表达组侵袭细胞数显著多于ｓｃｒａｍｂｌｅ组，（３２７±１８）个比（１１３±１０）个，Ｐ＜０．０ｌ。与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的细胞数在４８、７２ｈ培养后出现显著减少，４８ｈ时，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组相对细胞数为（４６．５±３．９）％比（１０２．３±２．９）％，Ｐ＜０．０１；７２ｈ时，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组相对细胞数为（３２．６±１．９）％比（１０４．２４－３．７）％，Ｐ＜０．ｏｌ；ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组侵袭细胞数湿著低于ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组［（４１±９）个比（９９±１３）个，Ｐ＜０．０１］。与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ．３２组ＫＬＦ４基因的ｍＲＮＡ水平显著上升（１０．３±１．９比１．８±０．３，Ｐ＜０．０１）；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示，与ｌｅｎｔ．ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的ＭＧＣ８－０３细胞中，ＫＬＦ４蛋白表达量显著升高（３．７９±０．５４比１．３５±０．２１，Ｐ＜０．０１）。ｍｉＲ一３２过表达组ＫＬＦ４的ｍＲＮＡ及蛋白表达水平均显著低于ｓｃｒａｍｂｌｅ组，分别为０．２７±０．０５比１．００±０．１４，Ｐ＜０．０ｌ；１．１６±０．１３比３．２６±０．６５，Ｐ＜０．０１。结论ｍｉＲ一３２通过下调ＫＬＦ４基因表达而促进胃癌细胞增殖与侵袭。【关键词】微小ＲＮＡ．３２；胃癌；增殖；侵袭；Ｋｒｕｐｐｅｌ样因子４ＭｉｃｒｏＲＮＡ——３２ｐｒｏｍｏｔｅｓｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ・－ｓｉｏｎｏｆＫｒｕｐｐｅｌ—ｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ４耽ｉＫａｉ，Ｗａｎｇ肌ｉ，ＺｈａｎｇＴａｏ，ＣｈｅｎｇｙｏｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＷｕｈａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉ—ｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｗｕｈａｎ４３００１４．吼ｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷａｎｇＨｕｉ，Ｅｍａｉｆ：ｗａｎｇｈｕｉａｎｄｙ＠，卯．ｃｏｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ）一３２ｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｅｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ．ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈ－ｏｄｓＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ一３２ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｎｏｒｍａｌｇａｓｔｒｉｃｅｅｌｌ１ｉｎｅｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＦＱ—ＰＣＲ）．ＧａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｅｅｌｌｌｉｎｅＭＧＣ８—０３ｃｅＵｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ：ｍｉＲ一３２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ一３２ｍｉｍｉｃｓ，ｓｃｒａｍｂｌｅｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｃｒａｍｂｌｅ．１ｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２ｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２ａｎｄｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ｏｒ１ｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｂｙｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ．ＴｈｅｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＫｒｕｐｐｅｌ—ｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ４（ＫＬＦ４）ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＲｅｓｕｌｔｓＲｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ．ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１ｅｖｅｌｉｆｌｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉ—ａｌｃｅｌｌＧＥＳ一１．ｍｉＲ一３２ＲＮＡｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｆｉｖｅｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｅｅｌｌｌｉｎｅｓｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡＧＳ，ＫＡＴＯ—ｍ，ＭＧＣ８—０３．ＮＣｌ—Ｎ８７ａｎｄＳＧＣ一７９０ｌ，ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（０．１８４－０．０３ｖｓ．１２．４０±１．４０，３５．８０±２．１０．２７．１０４－３．６０，６．２０±１．６０ａｎｄ８．５０±３．５０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆ万方数据・实验研究・生堡塞验处型苤查！Ｑ！！笙！！旦筮！！鲞筮！！塑ｇ！堕』垦业！！垡：望！！！坐！型！！！！：！！！：！！：塑！．！！ＭＧＣ８——０３ｃｅｌｌｓｉｎｍｉＲ——３２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｓｃｒａｍｂｌｅｇｒｏｕｐａｔ・２７０７・４８ｏｒ７２ｈａｓｃｏｍｐａｒｅｄＩ（１６０．３±５．４）％ＶＳ．（１０４．２±３．８）％ａｔ４８ｈ，Ｐ＜０．叭；（３１０．２±５．４）％ＶＳ．（１０７．２±２．９）％ａｔ７２ｈ，Ｐ＜０．０１Ｉ．Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｃｒａｍｂｌｅｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｉｎｖａｓｉｏｎｃｅｌｌｓｉｎｍｉＲ一３２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓｗｅｌｌ［（３２７±１８）ＶＳ．（１１３±１０），Ｐ＜Ｏ．０１］．Ｔｈｅｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｉｎｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２ｇｒｏｕｐｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒｇｒｏｕｐａｔ４８ｏｒ７２ｈａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ『（４６．５±３．９）％ＶＳ．（１０２．３±２．９）％ａｔａｔ４８ｈ，Ｐ＜０．０１；（４６．５±３．９）％ＶＳ．（１０２．３±２．９）％７２ｈ．Ｐ＜０．０１］．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｉｎｖａｓｉｖｅｃｅｌｌｓｉｎｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２ｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｅｓｓｔｈａｎｉｎｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒｇｒｏｕｐ［（４１±９）ＶＳ．（９９４－１３），Ｐ＜０．０１］．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖ—ｅｌｏｆＫＬＦ４ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２ｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｉｎｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒｇｒｏｕｐ［（１０．３±１．９）ＶＳ．（１．８±０．３），Ｐ＜０．０ｌ；（３．７９±０．５４）ＶＳ．（１．３５±０．２１），Ｐ＜０．０１］．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＫＬＦ４ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｉｆｌｍｉＲ一３２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｓｃｒａｍｂｌｅａｓｇｒｏｕｐ［（Ｏ．２７±０．０５）ＶＳ．（１．（）【）±Ｏ．１４），Ｐ＜０．０１；（１．１６±０．１３）ＶＳ．（３．２６±ｍｉＲ一３２ｐｒｏｍｏｔｅｓｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｂｙ０．６５）．Ｐ＜０．０１］．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＬＦ４．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｆａｃｔｏｒ４ＭｉｃｒｏＲＮＡ一３２；Ｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｉｎｖａｓｉｏｎ；Ｋｒｕｐｐｅｌ—ｌｉｋｅ微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ）是一种内源性的非编码ＲＮＡ，长度在２０ｎｔ左右，其能在转录后水平通过与靶（ＦＱ．ＰＣＲ）：细胞总ＲＮＡ采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂进行提取。ｃＤＮＡｓ通过ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＰｒｅｍｉｘ基因结合，促进靶ｍＲＮＡ的降解及抑制其翻译’１Ｊ。公司）的反转录反应合成。ＦＱ．ＰＣＲ采用ＳＹＢＲＥｘＴａｑ。”１１（ＴｌｉＲＮａｓｅＨｍｉＲＮＡ被报道与细胞增殖、凋亡、细胞周期调控、转移Ｐｌｕｓ）试剂盒，使用ＡＢＩ公司及侵袭、肿瘤发生等多种功能相关。２。ｏ。ｍｉＲ一３２已被证实在多种肿瘤的发病中具有重要作用。例如，ｍｉＲ一３２能显著促进乳腺癌和非小细胞肺癌的增殖”。５１；ｍｉＲ．３２能显著促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭∞Ｊ。我们于２０１５年１月至２０１６年１月，观察的ＦＱ．ＰＣＲ仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）进行分析。采用ｕ６以及ＧＡＰＤＨ作为内参。具体引物序列如下：ｕ６（正向：５’一ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ一３’，反向５’一ＡＡＣＧＣＴＩ＂ＣＡＣＧＡＡ，兀Ｔ１１ＧＣＧＴ一３’），ＫＬＦ４（正向：５’一ＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡ．３’，反向：５’一ＴＣＡＴＧＴＧＴＡ．ＡＧＧＣＧＡＧＧＴ．３’），ＧＡＰＤＨ（正向：５’－ＴＡＴＧＡＣＡＡ－ＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴ．３’，反向：５’一ＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴ－ｍｉＲ一３２对胃癌细胞增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。材料与方法１．材料：ＲＰＭＩ１６４０培养基、胎牛血清（ＦＢＳ）、以及胰蛋白酶均购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。Ｔｒｉｚｏｌ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ所用的一抗包括：抗ＡＣＣＡ一３’）。４．细胞增殖实验：细胞增殖实验采用ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ实时细胞定量分析仪（美国ＡｃｅａＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＲｏｃｈｅＳｃｉｅｎｃｅ公司）对细胞数量进行计算。ＭＧＣ８－０３细胞采用９６孑Ｌ板进行细胞培养。细胞数目可直接由仪器读出。５．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验：采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验。２×１０４个检测细胞接种在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室的碳酸磷脂表面，上室ＢｉｏＣｏａｔⅢ包被Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质胶（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＫｒｕｐｐｅｌ样因子４（ＫＬＦ４）和抗甘油醛一３一磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗购自英国Ａｂｃａｍ公司。ｍｉＲ一３２ｍｉｍｉｃｓ以及Ｓｃｒａｍｂｌｅ均由上海吉马公司定制合成，慢病毒ｌｅｎｔｉ—ｓｈｍｉＲ一３２及ｌｅｎｔ－ｖｅｃｔｏｒ由美国Ｇｅｎｅ公司定制。２．细胞培养和转染分组：ＧＥＳ一１及５种胃癌细胞株（ＭＧＣ８－０３、ＮＣＩ—Ｎ８７、ＡＧＳ、ＳＧＣ－７９０１、ＫＡＴＯ．ｍ）均用ＲＰＭＩ１６４０培养基（添加１０％胎牛血清以及抗生ＣｏｐｏｅｉａＪｏｓｅ，ＣＡ），３７℃培养细胞２４ｈ，取出上层小室，将膜下面的侵袭细胞与１％多聚甲醛混合，用０．２％（ｗ／ｖ）结晶紫溶液染色１５ｍｉｎ。用显微镜计数进入膜下的细胞量，随机取１０个视野，取平均值。６．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ素）于３７ｑＣ、５％ＣＯ：、饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。将胃癌细胞株ＭＧＣ８－０３分成４组，ｍｉＲ一３２过表达组、ｓｃｒａｍｂｌｅ组、ｌｅｎｔ－ｓｈｍｉＲ一３２组和ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００和慢病毒分别转染ｍｉＲ．３２ｂｌｏｔ法，加入相应的一抗（１：２００），ＨＲＰ标记的二抗均以１：２０００的浓度孵育，通过增强型化学发光试剂（ＥＣＬ）法进行显影。７．统计学方法：采用Ｇｒａｐｈｐａｄ６．０统计作图软ｍｉｍｉｃｓ、ｓｃｒａｍｂｌｅ、ｌｅｎｔ．ｓｈｍｉＲ．３２和ｌｅｎｔ．ｖｅｃｔｏｒ，培养２４后行细胞增殖实验及Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验。ｈ件，计量资料用均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，两组均数采用ｔ检验，配对的两组均数采用配对ｔ检验，多组均数３．ＲＮＡ提取以及实时荧光定量聚合酶链反应比较采用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计万方数据・２７０８・生堡塞验处型盘查！！！！笙！！旦箜！！鲞笠！！塑ｇ丛！』垦！Ｐ坠望：望！！！坐！堕！！！！：！！！．！！：盟！．！１学意义。结果１．ｍｉＲ一３２在胃癌细胞株中比正常胃表皮细胞株高表达，ＶＱ—ＰＣＲ显示，与胃部组织细胞株ＧＥＳ一１比较，ｍｉＲ．３２基因的表达量在５种胃癌细胞株（ＭＧＣ８－０３、ＮＣＩ—Ｎ８７、ＡＧＳ、ＳＧＣ－７９０１和ＫＡＴＯ一１１）中均出现显著高表达（Ｐ＜０．０１）。２过表达ｍｉＲ．３２促进胃癌细胞增殖与侵袭，将胃癌细胞株ＭＧＣ８－０３分两组，ｍｉＲ．３２过表达组和ｓｃｒａｍｂｌｅ组，分别转染ｍｉＲ一３２ｍｉｍｉｃｓ和ｓｃｒａｍｂｌｅ２４ｈ后，ｍｉＲ．３２过表达组ｍｉＲ一３２的表达量显著高于ｓｃｒａｍｂｌｅ组，Ｐ＜０．０１；与ｓｃｒａｍｂｌｅ组比较，ｍｉＲ一３２过表达组的ＭＧＣ８－０３细胞数在４８、７２ｈ培养后出现显著增加（Ｐ＜０．０１）；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验显示，与ｓｃｒａｍｂｌｅ组比较，ｍｉＲ．３２过表达组侵袭细胞数显著增加。３．ｍｉＲ．３２沉默抑制胃癌细胞增殖与侵袭，将ＭＧＣ８－０３细胞分成两组，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组和ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组，分别转染ｌｅｎｔ．ｓｈｍｉＲ一３２和ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ，转染２４ｈ后，ＶＱ．ＰＣＲ显示ＭＧＣ８－０３细胞株ｍｉＲ一３２的表达量显著下降，与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的ＭＧＣ８－０３细胞，其细胞数在４８、７２ｈ培养后出现显著减少（Ｐ＜０．０１）；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验示，与ｌｅｎｔ．ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ－ｓｈｍｉＲ一３２组的ＭＧＣ８－０３细胞，其侵袭细胞数显著减少（Ｐ＜０．０１）。４．ｍｉＲ．３２抑制ＫＬＦ４的基因表达，ＶＱ．ＰＣＲ显示，与胃部组织细胞株ＧＥＳ一１比较，ＫＬＦ４基因的ｍＲＮＡ水平在５种胃癌细胞株中均出现显著低表达（Ｐ＜０．０１）；与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的ＭＧＣ８－０３细胞中，ＫＬＦ４基因的ｍＲＮＡ水平显著上升（Ｐ＜０．０１）；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示，与ｌｅｎｔ—ｖｅｃｔｏｒ组比较，ｌｅｎｔ．ｓｈｍｉＲ．３２组的ＭＧＣ８－０３细胞中，ＫＬＦ４基因的表达量显著升高。ｍｉＲ一３２过表达组ＭＧＣ８－０３其ＫＬＦ４基因的ｍＲＮＡ以及蛋白水平均显著下降（Ｐ＜０．０１）。讨论本研究结果显示，比较于ＧＥＳ－１细胞，在５种胃癌细胞株中ｍｉＲ一３２都存在显著高表达。提示ｍｉＲ－３２与胃癌明显相关。通过向胃癌细胞株ＭＧＣ８－０３转染ｍｉＲ．３２ｍｉｍｉｃｓ．比较于ｓｃｒａｍｂｌｅ组，ＶＱ—ＰＣＲ结果显示，ｍｉｍｉｃｓ组胃癌细胞实现了ｍｉＲ一３２的过表达。通过测算细胞数，在经过４８ｈ和７２ｈ培养后，ｍｉＲ一３２ｍｉｍｉｃｓ组的细胞数均出现显著增高。说明过表达ｍｉＲ一３２能万方数据显著促进胃癌细胞增殖。通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验，可见ｍｉＲ．３２ｍｉｍｉｃｓ组的迁移细胞数均出现显著增多。说明过表达ｍｉＲ．３２显著促进了胃癌细胞的侵袭。反之，通过向ＭＧＣ８－０３分别转染ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ．３２，比较于ｖｅｃｔｏｒ组，ＦＱ．ＰＣＲ结果显示，ｌｅｎｔ．ｓｈｍｉＲ一３２组胃癌细胞实现了ｍｉＲ一３２的基因沉默。测算细胞数，在经过４８ｈ和７２ｈ培养后，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的细胞数均出现显著下降。说明ｍｉＲ一３２基因沉默能显著抑制胃癌细胞增殖，ｌｅｎｔ—ｓｈｍｉＲ一３２组的侵袭细胞数均出现显著降低，说明对ｍｉＲ一３２基因沉默显著抑制了胃癌细胞的侵袭。本实验结果显示ｍｉＲ一３２在胃癌细胞中显著高表达，并且ｍｉＲ一３２能显著促进胃癌细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，比较于ＧＥＳ一１，５种胃癌细胞株均表现ＫＬＦ４基因的低表达。接下来通过ＶＱ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术，结果显示在ｍｉＲ．３２过表达的ＭＧＣ８－０３中，ＫＬＦ４的基因表达量显著降低；而在ｍｉＲ．３２基因沉默的ＭＧＣ８－０３细胞中，ＫＬＦ４基因表达显著增加。因此，ｍｉＲ．３２在胃癌细胞中能显著抑制ＫＬＦ４的基因表达。由于ＫＬＦ４已经被证实对胃癌细胞的增殖、侵袭具有重要抑制作用，因此，ｍｉＲ－３２对胃癌细胞的调控作用是通过对ＫＬＦ４的基因表达抑制而实现的。本研究结果显示ｍｉＲ．３２具有促进胃癌细胞增殖以及迁移的功能，并且其作用机制在于对胃癌抑制基因ＫＬＦ４的基因表达抑制。１一～～～２一一一一３。一一～一４～一㈣一～５６一～一一一一一～一一～一