起草人 审核人 批准人 起草日期 审核日期 批准日期 分发清单 颁发部门 质量管理部 生效日期 1.
2.
目的
研发部[ ]质量管理部[ ] 综合管理部[ ]生产管理部[ ] 市场销售部[ ]财务部[ ] 指导并规范直接培养法检测小牛血清支原体的操作。 适用范围
本程序包括初次接种培养、第7天转种培养、结果判定标准及培养基的最终处理。适用于小牛血清支原体直接培养法检查的全过程。
3. 3.1 3.2 3.3 4. 5.
6. 6.1 6.1.1 6.1.3 6.1.4 6.2 6.2.1 6.2.2
职责
质控部负责本程序的起草 总经理负责本程序的审批 质控检验人员负责本程序的操作 定义 引用标准
《中华人民共和国药典》四部 2015版 材料及设备 试剂
供试品 小牛血清，8ml以上
效期内灭活小牛血清，使用前确认批号、有效期，并填写相应记录。 阴性对照：无菌生理盐水（安瓿瓶2ml/瓶） 10ml 培养基
效期内支原体肉汤培养基8ml /支（中管），4支（初种）和8支（转种）。记录批号及有效期。
效期内支原体半流体培养基8ml /支（中管），4支（初种）和8支（复种）。
6.3 6.4 6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.5 6.5.1 6.5.2 7.
8. 8.1 8.1.1 8.1.1.1 8.1.1.2 8.1.1.3 8.1.1.4
8.1.1.5
8.1.1.6
8.1.1.6.1 8.1.1.6.2 8.1.1.6.3 8.1.1.6.4 8.1.2.
记录批号及有效期。
用具
1ml刻度吸管、10ml 刻度吸管。清洗、灭菌参《玻璃器皿的清洗灭菌程序》 设备 生物安全柜。 35～37℃孵箱。 电磁炉 其它
无菌医疗用品无菌帽、无菌口罩和橡胶检查手套。记录批号。
75%酒精棉，参见《75%酒精棉配制程序》SXRS-SOP 02-1-0-70。记录批号。 流程图 无 内容
初次接种和培养观察
操作前准备——支原体半流体培养基融化： 将支原体半流体培养基放入不锈钢锅内。 用电磁炉加热10～15分钟，使其完全融解。 冷却至触摸不烫手
供试品、培养基、小牛血清、灭菌物品、75%酒精棉、记号笔、试管架放在操作间。
标记培养基：用记号笔在支原体肉汤培养基和支原体半流体培养基中管外壁注明阴性对照和供试品名称、批号、接种日期。
补加灭活小牛血清：
用75%酒精棉擦拭小牛血清瓶。 无菌开启瓶塞。
吸取灭活小牛血清，每支支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基中各加入
2ml（培养基:血清为8:2）。
直到所有供试品的支原体培养基补加完毕。 阴性对照接种：
8.1.2.1 8.1.2.2 8.1.2.3 8.1.3 8.1.3.1 8.1.3.2 8.1.3.3 8.1.3.4 8.1.3.5 8.1.3.6 8.1.3.7 8.1.3.8 8.1.3.9
8.2 8.2.1 8.2.2
8.2.3 8.2.4 8.2.5
8.2.5.1.
支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基各取4支。 每支分别接种无菌生理盐水各1ml，塞上相应的橡胶塞。 注明阴性对照批号、接种日期、判定日期 供试品接种：
用吸管吸取供试品接种支原体肉汤培养基4支，1ml/支。 塞上相应的橡胶塞。。
另取吸管吸取同样供试品接种支原体半流体培养基4支，1ml/支。 塞上相应的橡胶塞
注明供试品名称、批号、接种日期。
同样的方法对下一个供试品进行接种，直到所有供试品接种完成。 置入35～37℃孵箱培养21天，每隔3天观察1次。 接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养。
清场。参见《QC清场管理程序》SXRS-SOP 09-1-0-77。填写试验记录和清场记录。复核人复核并签字。
第7天转种和培养观察
所需材料及操作前的准备同8.1.1
在每一个供试品准备转种的8支支原体半流体培养基和8支支原体肉汤培养基中管瓶口写明所需转种供试品的名称、批号、转种日期。
补加灭活小牛血清：参见8.1.1.6项。 阴性对照接种：参见8.1.2.项。
供试品转种： 于初次接种后的第七天，每种培养基各从4支中取2支进行次代培养。
用吸管吸取初次培养的支原体半流体培养基加入支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基各2支，1ml/支。
8.2.5.2 8.2.5.3 8.2.5.4 8.2.5.5 8.2.5.6
8.2.6 8.3 8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.3.1 8.3.3.2
8.3.3.2.1 8.3.3.2.2 8.5 8.5.1
8.5.2 9. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4
用吸管吸取初次培养的支原体肉汤培养基加入支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基各2支，1ml/支。
同样的方法对下一个供试品进行转种，直到所有供试品转种完成。 试管架上贴上标签，注明供试品名称、批号、转种日期。 置入35～37℃孵箱，培养21天，每隔3天观察1次。
初次培养的2支支原体半流体培养基和2支支原体肉汤培养基放回原试管架上继续培养14天。
清场。参见《QC清场管理程序》，填写清场记录。 试验结果评估和记录
初次培养至21天时观察结果，填写相应记录。 转种后培养21天观察结果，填写相应记录。 判定标准
供试品初次培养、转种后培养、阴性对照均无支原体生长判为合格。 如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试。
如无支原体生长，供试品判为合格。 如有支原体生长，供试品判为不合格。 培养基处理
观察结果之后，除特殊情况需留待观察或进一步分析的培养基外，本程序使用过的培养基应及时高压灭菌处理。
消毒后的培养基返回培养基制备室。 注意事项
严格按照GMP要求规范操作，以防止检定结果不成立。 注意不得混淆不同名称和批号供试品 使用的计量器具应经过计量校验
出现超标结果，应在试验记录中如实记录。
9.5 10. 10.1. 11. 11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. 11.7. 12. 修订号 1
出现OOS情况，应及时报告主管。参见《质量检验超出标准调查分析程序》，完成OOS记录。 附录及派生记录
支原体（培养法）检测记录F-SOP-ZL005-01 相关文件
《CO2孵箱使用、灭菌及维护程序》 《物品准备程序SXRS-SOP》 《75%酒精棉配制程序》 《人员进出洁净厂房程序》 《生物安全柜使用及维护程序》 《QC清场管理程序》
《质量检验超出标准调查分析程序》 修订记录
修改内容 引用标准修订为《中国药典2015版》四部 生效日期 2015年12月1日
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