疾病防治Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 牛支原体及其支原体病诊断技术研究进展 范 媛。 ’，谢光武。 ’，陈忠琼’，黎晓敏 （１．西南大学动物科技学院，重庆４００７１５；２．重庆市万州动物卫生监督所，重庆４０４０２０） 摘要：随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体，可导致牛 肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病，造成巨大经济损失。文章综述了牛支原体的分离培养法、免疫学方法和核酸 诊断技术。 关键词：牛支原体；诊断技术；研究进展 中图分类号：￥８２３；￥８１４文献标志码：Ａ文章编号；】００１—００８４（２０１２）０６—００４４—０３ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｂｏｖｉｓ Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ ＦＡＮ Ｙｕａｎ’一，ＸＩＥ Ｇｕａｎｇｗｕ 一，ＣＨＥＮ Ｚｈｏｎｇｑｉｏｎｇ ，ＬＩ Ｘｉａｏｍｉｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｌ＇ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１５，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｗａｎｚｈｏｕ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０４０２０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｂｅｃａｍｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐａｔｈｏ— ｇｅｎ ｔｏ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ— ｌｙ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｎｄ ｍａｓｔｉｔｉｓ，ｆｏｒｍ ｗｈｉｃｈ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍａｙ ｒｅｓｕｌｔ，ＳＯ ｔｈａｔ ｉｔ ｂｒｉｇｈｔ ａ ｈｕｇｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｌｏｓｓ．Ｔｈｉｓ ｐａｐｔｅｓ ｓｕｍｍａｒｉｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ— ｉｓｔｉｃ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ；ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ 牛支原体是危害养牛业的一种重要的致病性支 原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还 目前，牛支原体在我国虽小规模流行且未造成重大 经济损失，但也给我国养牛业敲响了警钟。同时， 导致角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不 孕等多种疾病。１９６１年，美国人Ｈａｌｅ首次从患乳 腺炎的牛乳中分离得到牛支原体，１９７６年报道其 与牛呼吸系统疾病有关…。目前，该病原在世界范 同内普遍存在，造成严重的经济损失，以欧 Ｉ和美 国损失最为严重 。Ｉｏ我国于２００８年６月起，相继 由于牛感染后，其临床症状和病理剖检变化特征性 不强，与传染性胸膜肺炎非常相似，因而，实验室 诊断结果对于该病的最终确诊意义重大。 外国很早就开展了该病原体的诊断技术研究， 例如病原体的分离培养法、免疫学方法、核酸诊断 方法等；我国的实验室诊断技术虽处于起步阶段， 在湖北、重庆、山东等地区发现以无名发热、咳嗽 等临床症状，且以坏死性肺炎为主的牛传染性疫病 病例，随后，证实了其主要致病原为牛支原体 。－。 收稿日期：２０１２～０４—１７ 但已取得一定的成绩。现就国内外牛支原体感染的 诊断技术研究情况进行综述，以期达到快速鉴别、 诊断，及时防治防控的目的。 基金项目：重庆市科委重大科技项目（Ｃｓ ｒＧ２０１０ＡＡ１０２１） 作者简介：范媛（１９８５一），女，重庆人，硕士，主要从事实验室监测与重大动物疫病防控工作。 通讯作者：教授，硕士生导师，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｌｉｘｉａｏｍｉｎ６６２＠ｓｉｎａ．ＣＯｆｌｌ。 ４４饲料博览２０１２ｔ［ｚＪ￣６期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅ，，ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ疾病防治 １病原分离培养 从感染动物体内分离到牛支原体对于疾病的最 终诊断是必需的。牛支原体为胆固醇依赖性生长， 对其他营养物质需求不是十分苛刻，多种培养基上 均可生长，使用前需添加无菌马血清１０％～２０％、 酵母浸液及抗生素１％～１０％。液体培养３—１０ ｄ，通 气培养更加有利于其生长；固体培养需严格ＣＯ：浓 度，２～４ ｄ培养后，可得到典型油煎蛋样菌落， 有培养基内生长趋势，Ｅａｔｏｎ ｓ培养基上可出现膜 期致力于ＥＬＩＳＡ诊断技术的研究，先后有Ｈｏｗ． ａｒｄ、Ｂｏｏｔｈｂｙ、Ｈｅｌｌｅｒ等采用ＥＬＩＳＡ法直接用于奶 样、血清样品、组织样品培养物等样本的检测，从 而调查牛支原体感染情况和发病情况 。商品化的 ＥＬＩＳＡ试剂盒于１９９４年正式问世，广泛应用于各 养殖场牛支原体流行病学的血清学调查分析。之 后，以脂蛋白ｐ４８作为包被抗原的ＥＬＩＳＡ以及单克 隆抗体包被的牛支原体阻断ＥＬＩＳＡ技术的问世，更 好地弥补了原有诊断技术的不足 。 和点现象。 牛支原体对外界环境十分敏感，采样与送检环 节的控制好坏亦可影响病原分离。Ｔｈｏｍａｓ等人已 证实，在由牛支原体所致的呼吸道系统疾病中，患 病牛只支气管肺泡灌洗液的病原体分离率高于鼻 腔 。新鲜的组织样品尽可能在２４ ｈ内进行无菌 分离培养，如不能及时分离，需保存于一７０℃条件 下。从拭子类样品的分离培养试验中发现，尼龙、 聚酯纤维类拭子样品的分离率显著高于传统棉签拭 子（Ｐ＜０．０５），这可能是前者对病原体毒害较小，且 能最大程度的增加标本的采集及释放量，有利于病 原分离培养 。组织样品在接种前，经滤膜滤过处 理后，可有效提高牛支原体的分离率 。待分离培 养后，再配合相应的染色技术、生化反应可对牛支 原体进行初步鉴定。 ２免疫学诊断技术 免疫学诊断技术一直是实验室诊断技术研究的 热点。该方法通过直接检测病原体和其相应的特异 性抗体，从而对牛支原体感染作出早期、快速和特 异的诊断。生长抑制试验（ＧＩ）、代谢抑制试验 （ＭＩ）、生物膜形成抑制试验（ＦＩ）是鉴别诊断技术中 最为常用的方法。除此之外，斑点免疫、免疫组化 技术在抗原检测中亦比较常见。Ｈａｉｎｅｓ等建立了牛 支原体免疫组织化学抗原检测技术，对牛场牛支原 体感染所致的急、慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎 等进行了病原体检测，同时，亦提示病原体数量、 定居部位与病理损伤程度、致病机理等之间可能存 在的联系 】。 在支原体的免疫学诊断研究中，ＥＬＩＳＡ作为免 疫诊断中的一项非常重要的技术，是最为广泛采用 的诊断技术。其灵敏度较好、特异性较高、简单、 快速且易于自动化操作等优点，非常适合临床样本 的检查和大规模的流行病学调查分析。外国学者长 ３核酸诊断技术 Ｈｏｔｚｅｌ和Ａｙｌｉｎｇ是最早采用扩增１６ｓ ｒＲＮＡ的 ＰＣＲ法进行牛支原体的病原学鉴定 】。但是，由于 ＰＣＲ技术存在种间交叉反应，特别是牛支原体与牛 无乳支原体有很高同源性，早期扩增牛支原体１６ｓ ｒＲＮＡ的ＰＣＲ法较难区分牛支原体感染或牛无乳支 原体感染。近年来，核酸放大技术（ＮＡＡＴｓ）的研究 与应用很好地解决了上述问题，其有利于基因诊断 技术在牛支原体感染实验室诊断中的应用。ＮＡＡＴｓ 不受病原体存活与否的影响，不用考虑抗体生成量 与时间的问题，因而能快速、准确诊断牛支原体感 染，这对于正确使用抗生素、降低牛支原体病的发 病率和死亡率以及流行病学调查具有十分重要的意 义。 Ｃａｉ等应用杂交探针和退火温度建立扩增１６ｓ ｒＲＮＡ基因序列的实时ＰＣＲ法，可有效与牛无乳支 原体区别鉴定，且灵敏度较高，特异性较强 。研 究人员通过扩增牛支原体ｕｖｒＣ基因所建立的ＰＣＲ 技术，可直接用于临床患病牛及带菌牛的奶样和鼻 拭子中牛支原体病原学鉴定，特异性较强，可区别 包括牛乳支原体在内的多种致病性支原体。除此之 外，ＡＴＰ结合蛋白ｏｐｐＤ／Ｆ基因和ＤＮＡ聚合酶Ⅲ 基因为目标基因的ＰＣＲ，已证实能够较好地区别 牛支原体与牛无乳支原体的感染。Ｆｏｄｄａｉ等采用牛 支原体ｐ８１基因序列设计并建立了多重ＰＣＲ诊断 技术，同时采用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ技术对序列进行比对分 析，可有效提高鉴定的特异性 。我国于２００８年 开始研究该病原，虽然时间较短，但也取得了一定 成绩。李媛等利用牛支原体的ｏｐｐＤ／Ｆ基因的两对 特异性引物，建立了灵敏度较高、特异性较强的牛 支原体套式ＰＣＲ检测技术ｎ 。有研究人员根据牛支 原体特异性基因ｕｖｒＣ设计４条引物，利用环介导 等温扩增（ＬＡＭＰ）技术建立牛支原体核酸快速检测 ２ｏ１２年第６期饲料博览４５ 疾病防治Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 方法，灵敏度可达３４ ｃｆｕ・ｍＬ～。李大伟等建立的三 重ＰＣＲ可１次鉴定牛支原体、无乳支原体和丝状 支原体丝状亚种小克隆，特异性较好，灵敏度较 高 １。 ４展望 在标本中分离培养出支原体对于牛支原体感 染的诊断有决定性意义，结合生化鉴定技术，可 作为实验室诊断牛支原体感染的基本诊断技术， 但不能作为确定感染的最终检测方法和结果。．这 是由于牛支原体培养要求条件高、程序繁琐、培 养周期相对较长，且两种鉴别法的特异性、敏感 性较差，不能与其他支原体进行区别鉴定。免疫 学诊断技术虽然操作简单，但仍存在缺陷。其具 有抗体依耐性，特别是在感染早期，血清中抗体 水平低，检测的敏感性低，因此达不到早期诊断 的目的；由于牛支原体与其他种类支原体、细菌 存在着某些结构或功能相似的抗原蛋白，会出现 免疫交叉反应，使检测方法的特异性降低。虽然 免疫组织化学法可以规避上述缺点，但是该法只 能针对局部小块病变组织，如果病灶选择偏差或 病情轻微时，免疫组化将很难检测到病原体。因 此，核酸诊断技术是牛支原体感染较为理想的诊 断方法。该法灵敏度高、特异性强，且不考虑菌 体死活、抗体产生等因素，对牛支原体感染的诊 断、防治与预后评估具有重要意义。 【参考文献】 胡长敏，石磊，龚瑞，等．牛支原体病研究进展ｌ Ｊｌｌ动物医学进 展，２００９．３０（８）：７３—７７． ［２］ Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ Ａ Ｊ，Ａｙｌｉｎｇ Ｒ Ｄ．Ｍｙｅｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ：ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｉａｇｎｏ— ｓｉｓ，ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，７４（２）： １Ｏ５一ｌ１２． ［３］ Ｃａｓｗｅｌｌ Ｊ Ｌ．Ａｒｅｈａｍｂａｕｈ Ｍ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ ｃａｔ－ ｔｋ『Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ，２００７，８（２）：１６１—１８６． ［４１ 辛九庆，李媛，郭丹，等．国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离 到牛支原体ｆＪ１．中国预防兽医学报，２００８，３Ｏ（９）：６６１—６６４． 【５】 冉智光，谢建华，骆璐，等．我国部分地区牛支原体肺炎和关节 炎的病原体诊断［ＪＩ．中国预防兽医学报，２０１０，３２（１）：４０—４３． ［６］ Ｔｈｏｍａｓ Ａ，Ｄｉｚｉｅｒ Ｉ，Ｔｒｏｌｉｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｐｒｏｃｅ— ｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００２，２６（５）：３３３—３３９． ４６饲料博览２０１２年第６期 【７】 Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ Ｐ，Ｂｒｏｏｋｓ Ｃ，Ｂａｌｌ Ｈ Ｊ．Ｆｉｈｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｂｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ【ＪＪ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃ，２００８，１６３：５ ｌ４—５ ｌ５． ［８ １ Ｈａｉｎｅｓ Ｄ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋ Ｍ，Ｃｌａｒｋ Ｅ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉ． ｎｒｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｆｅｅｄｌｏｔ ｃａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ，ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｓｐｉｒａ— ｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ／ｏｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ．Ｃａｎ Ｖｅｔ Ｊ，２００１，４２（１１）：８５７— ８６０． 【９］ Ｒｏｂｉｎｏ Ｐ，Ａｌｂｅｒｔｉ Ａ，Ｐｉｔｔａｕ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｈａｒａｅ— ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ４８ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ［Ｊ］． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１０９（３—４）：２０１—２０９． ［１Ｏ］ Ｇｈａｄｅｒｓｏｈｉ Ａ，Ｆａｙａｚｉ Ｚ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｅｌｏ— ｈａｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃａｔｔｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒ． ｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｎｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００５，１０４（３－４）：１８３— １９３． 【１１］ Ｇａｇｅａ Ｍ １．Ｂａｔｅｍａｎ Ｋ Ｇ，Ｓｈａｎａｈａｎ Ｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒ— ｒｉｎｇ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎ— ｖｅｓｔ，２００６，１８（１）：２９—４０． ［１２］ Ｈａｉｎｅｓ Ｄ Ｍ，Ｍｏｌｉｎｅ Ｋ Ｍ，Ｓａｒｇｅｎｔ Ｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ— ｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ，Ｍｙｃｏｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ，ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ，ａｎｄ ｂｏｙｌｅ ｖｉｒａｌ ｄｅａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｄｅａｔｈ ｏｓｓｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｉｎ ｆｅｅｄｌｏｔ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｃａｎ Ｖ ｅｔ Ｊ ２００４，４５（３）：２３ １—２３４． ［１３］ Ｏ Ｃｏｎｎｏｒ Ａ，Ｍａｒｔｉｎ Ｓ Ｗ，Ｎａｇｙ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｉｔｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｅｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ Ｏｎｔａｒｉｏ ｆｅｅｄｌｏｔｓ［Ｊ］．Ｃａｎ Ｖｅｔ Ｊ，２００１，６５：１３７－１４２． ［１４］ Ｓｈａｈｆｉａｒ Ｆ Ｍ，Ｃｌａｒｋ Ｅ Ｇ，Ｊａｎｚｅｎ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｉｎ ｆｅｅｄｌｏｔ ｅａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ［Ｊ］．Ｃａｎ Ｖｅｔ Ｊ，２００２，４３：８６３－８６８． ［１５］ Ｃａｉ Ｈ Ｙ，Ｂｅｌｌ Ｒ Ｐ，Ｐａｒｋｅｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ『川．Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００５，ｌ７（６）：５３７—５４５． ［１６］ Ｆｏｄｄａｉ Ａ，Ｉｄｉｎｉ Ｇ，Ｆｕｓｃｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｍｕｌｔｉ— ｐｌｅｘ－ＰＣＲ ａｎｄ ａ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ２００５ １９（３）：２０７—２１２ ［１７］ 李媛，董惠，张美晶，等．牛支原体套式ＰＣＲ检测方法的建立 ［ＪＪ．中闰畜牧兽医学报，２００９，３ｌ（９）：７０９—７１１． ［１８］ 李大伟，黄灿平，张彦明，等．牛支原体、无乳支原体和丝状支 原体丝状亚种小克隆三重ＰＣＲ检测方法的建立及初步应用 ［Ｊ１．畜牧兽医学报，２０１１，４２（２）：３０６—３１０．