(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112522381 A(43)申请公布日 2021.03.19
(21)申请号 202011430980.0(22)申请日 2020.12.07
(71)申请人 苏州赛美科基因科技有限公司
地址 215100 江苏省苏州市相城区高铁新
城青龙港路58号天成时代商务广场17层(72)发明人 杨锋 余伟师 梁萌萌 (74)专利代理机构 南京九致知识产权代理事务
所(普通合伙) 32307
代理人 韩莲(51)Int.Cl.
C12Q 1/6869(2018.01)
权利要求书1页 说明书6页序列表19页 附图1页
CN 112522381 A(54)发明名称
一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法(57)摘要
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，包括：针对多个待检测位点或区域，分别设计一对正链探针和负链探针；使用所述正链探针和所述负链探针进行组合得到组合探针，并基于组合探针对待测DNA进行第一轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增得到的产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对第一轮PCR扩增得到的产物进行第二轮PCR扩增；对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序；对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析。解决了现有技术中无法做到基因区域点突变及拷贝数变异在一种技术中同时检测的问题。
CN 112522381 A
权 利 要 求 书
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1.一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，包括：针对多个待检测位点或区域，分别设计一对正链探针和负链探针，每一对正链探针和负链探针中的正链探针位于基因组序列的正链上，每一对正链探针和负链探针中的负链探针位于基因组序列的负链上；
使用所述正链探针和所述负链探针进行组合得到组合探针，并基于组合探针对待测DNA通过低循环扩增技术进行第一轮PCR扩增；定义，低循环扩增技术的扩增次数介于12‑18次；
对第一轮PCR扩增得到的产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对第一轮PCR扩增得到的产物进行第二轮PCR扩增；
对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序；
对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析；其中，所述正链探针和负链探针的5’端部分序列具有与所述第二轮PCR扩增的PCR扩增引物相一致的通用序列；
所述正链探针和所述负链探针3’端部分为与待检测位点所在5’端上游区域特异性结合的序列。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，所述正链探针或负链探针长度为18‑36bp。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，所述正链探针或负链探针长度为20‑27bp。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序时测序读长为PE150‑300bp。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序时平均测序深度大于5000X。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，第二轮PCR扩增过程中，来自不同样本的扩增产物用带不同标签序列的PCR引物进行扩增。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，其特征在于，对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析，包括：首先根据数个至数十个碱基长度的标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上；然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上；对于目标位点各碱基类型计数，进行目标位点基因型判定及拷贝数分析。
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说 明 书
一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法
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技术领域
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法。
背景技术
[0002]基因是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。除了部分病毒遗传物质是RNA外，几乎所有非病毒生物的遗传物质是DNA。不同物种都有其特异的基因序列，因此通过检测样品中的基因序列可以判断样品中存在的生物种性。细胞在生命过程中，基因通过DNA转录成mRNA，然后细胞以mRNA为模板翻译出有生物活性的蛋白质分子，从而将贮存在DNA序列中遗传信息表现出来。基因一方面能能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；另一方面基因在复制过程中也会出现差错产生“突变”。这种突变包括点突变、大片段缺失/重复(称为拷贝数多态，CNV)、基因倒位或基因易位等。有的突变会严重影响关键基因的功能从而导致疾病，由于受到选择作用，这类突变在群体中的频率非常低，而相当一部分突变由于并未严重影响基因功能或影响的基因并不对个体造成生存压力，他们在群体中会保留下来并由于受到随机漂变以及奠基者效应发生频率的改变，从而成为群体中的一种遗传多态，对于单碱基或寡碱基改变的多态被称之为单核苷酸多态(SNP)，而对于大区段的缺失或重复多态被称之为拷贝数多态(CNP)。
[0003]遗传多态以及基因突变分析是研究基因功能以及遗传性疾病的致病机理最常见的遗传分析方法。因此，基因鉴定、基因表达分析、DNA甲基化分析、突变筛查、SNP分型、CNP分型以及CNV检测是重要的分子遗传学研究手段，而且在临床分子诊断上也有着广泛的应用(Varela MA et al,2010)。正因为这些遗传分析的重要性，对于每一种分析，科学家及工程师们都开发出了多种检测方法。
[0004]但申请人在实际应用中发现现有技术的手段仍然存在如下技术问题：早期的检测方法主要针对有限的目的片段分析。用于SNP检测的方法如TaqMan探针等位基因检测技术、限制性内切酶反应(RFLP)、高分辨率融解曲线反应、单碱基延伸技术等。中小通量CNV的检测方法主要包括实时定量PCR、FISH、多重连接探针扩增技术(MLPA)等。上述方法灵活性很高，但最大的缺陷是通量太低，往往需要结合不同技术对基因区域位点及拷贝数进行检测，对于需要检测大量基因位点的研究项目或诊断需求时就显得无能为力了。[0005]微阵列芯片(Microarray)以高密度探针阵列为特征，利用分子杂交原理,将各种处理过的荧光标记样本与微阵列探针进行杂交，然后经过洗涤去除非特异杂交信号，最后用扫描仪进行荧光检测，根据荧光信号的强弱以及荧光信号所在的阵列位置确认目的基因相关的信号量(Maskos U et al,1992)。微阵列芯片最大的优势就是高通量，能够在整个基因组水平上分析基因的变化，但其缺陷是由于普遍存在非特异性杂交，定量的准确性较差，同时需要昂贵的杂交及扫描仪器，成本高而且定制芯片时间长费用高，对未知基因无法实现检测。
[0006]下一代测序技术的出现给基因检测领域带来个革命性的变化。定制合成混合寡核
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苷酸(探针)在液相中对剪切的基因组DNA样本进行杂交捕获是一种可以捕获较大区域的方法。高通量测序技术的最大的优势就是通量很大。这种富集技术主要用于候选基因的突变检测，但由于这些富集过程在一定程度上消除了产物与原始模板量的正比关系，因此不能准确实现对富集的候选基因片段进行定量分析，如表达量以及拷贝数分析。发明内容
[0007]本申请实施例通过提供一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，解决了现有技术中无法做到基因区域点突变及拷贝数变异在一种技术中同时检测的问题。[0008]本申请实施例提供了一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，包括：[0009]针对多个待检测位点或区域，分别设计一对正链探针和负链探针，每一对正链探针和负链探针中的正链探针位于基因组序列的正链上，每一对正链探针和负链探针中的负链探针位于基因组序列的负链上；使用所述正链探针和所述负链探针进行组合得到组合探针，并基于组合探针对待测DNA进行第一轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增得到的产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对第一轮PCR扩增得到的产物进行第二轮PCR扩增；对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序；对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析；其中，所述正链探针和负链探针的5’端部分序列具有与所述第二轮PCR扩增的PCR扩增引物相一致的通用序列；所述正链探针和所述负链探针3’端部分为与待检测位点所在5’端上游区域特异性结合的序列。[0010]作为本申请改进的技术方案，所述正链探针或负链探针长度为18‑36bp。[0011]作为本申请改进的技术方案，所述正链探针或负链探针长度为20‑27bp。[0012]作为本申请改进的技术方案，对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序时测序读长为PE150‑300bp。
[0013]作为本申请改进的技术方案，对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序时平均测序深度大于5000X。
[0014]作为本申请改进的技术方案，第二轮PCR扩增过程中，来自不同样本的扩增产物用带不同标签序列的PCR引物进行扩增。[0015]作为本申请改进的技术方案，对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析，包括：首先根据数个至数十个碱基长度的标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上；然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上；对于目标位点各碱基类型计数，进行目标位点基因型判定及拷贝数分析。[0016]本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：1、由于采用了高通量测序技术，因此能同时实现多个目的基因片段的分析，满足检测大量基因位点的需求。2、通过低循环扩增技术，扩增产物的量与原始模板量之间存在正比关系,同时由于不同基因片段的一轮扩增产物采用通用引物扩增，因此扩增产物的量很好地保留了原始模板的量的信息，利用该方法能够原始模板目的基因的量。3、探针设计无需特殊修饰或定制，大大降低了检测成本。[0017]综上，本申请的技术方案具有以下优点：1、检测通量的提高：一个反应可同时检测成千上万个位点；2、检测成本的降低：在非专有检测平台上应用，不需额外设备投入，同时一个检测反应能够完成几十个至几百个基因片段的分析，因此单个基因片段的检测成本大
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大降低；3、应用灵活：针对任意需要检测的目的基因片段能够快速建立检测体系；4、准确性提高：采用数字计数进行定量，因此大大提高准确性。5、检测灵敏度的提高：采用单分子扩增产物测序的序列鉴定以及数字计数定量方法可以大大提供灵敏度。附图说明
[0018]图1为本申请实施例一中高通量方法的技术流程图。[0019]图2阳性样本拷贝数分析结果。
具体实施方式
[0020]本申请的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种方法，用单分子扩增后测序或单分子直接测序以实现该技术在高通量单核苷酸多态性分型、拷贝数变异分型、突变筛查以及基因表达等方面的应用。为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。[0021]实施例一如图1所示，一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，包括：针对多个待检测位点或区域，分别设计一对正链探针和负链探针，每一对正链探针和负链探针中的正链探针位于基因组序列的正链上，每一对正链探针和负链探针中的负链探针位于基因组序列的负链上；所述正链探针或负链探针长度为18‑36bp，优选为20‑27bp。[0022]使用所述正链探针和所述负链探针进行组合得到组合探针，并基于组合探针对待测DNA进行第一轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增得到的产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的通用扩增引物对其进行扩增，通常情况下，通用扩增引物还有一段数个至数十个碱基长度的标签序列，来自不同样本的扩增产物可以用带不同标签序列的通用扩增引物进行扩增，这样不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去；对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序；对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序时测序读长为PE150‑300bp、平均测序深度大于5000X。
[0023]对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析；其中，所述正链探针和负链探针的5’端部分序列具有与所述第二轮PCR扩增的PCR扩增引物相一致的通用序列；对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析，包括：首先根据数个至数十个碱基长度的标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上；然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上；对于目标位点各碱基类型计数，进行目标位点基因型判定及拷贝数分析。所述正链探针和所述负链探针3’端部分为与待检测位点所在5’端上游区域特异性结合的序列。
[0024]上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：1、同时对多个目的基因片段的分析，检测通量高。2、保持扩增产物的量与原始模板量之间存在正比关系,同时由于不同基因片段的一轮扩增产物采用通用引物扩增，能够准确的检测基因拷贝数。3、探针设计无需特殊修饰或定制，大大降低了检测成本。
[0025]实施例二针对4个基因(ATP7B,NF1,TSC1,TSC2)的编码区域设计探针，探针及通用引物信息见表1：[0026]表1
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已知突变型的三个阳性样本使用各位点正链探针与负链探针混合液进行PCR扩增
得到扩增产物；将两个panel的扩增产物混合，然后通用带不同标签序列的illumina测序平台兼容的PCR引物进行扩增，各样本产物均匀混合后上illumina测序仪器进行PE150模式测序，测序数据进行后续分析。[0030]实验流程：(1)对野生型样本和突变样本进行浓度定量；(2)配置两个panel正链探
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针与负链探针混合液，各引物浓度均为2uM；取10‑100ng基因组DNA作为模板进行PCR反应，反应体系20ul，包含10u1 2x HIFI multi PCR master mix，2u1 Pmix1 for P1或Pmix2 for P2，2ul连接纯化产物，6ul无菌水；其PCR程序为:98℃2min；18x(96℃20s,60℃4min)；ho1d at 10℃，P1和P2等比例混合后使用DNA纯化磁珠试剂盒按1.8X比例对反应产物进行纯化；(4)使用带不同标签序列的illumina测序平台兼容的PCR引物UNIPCRF/UDIRxxxx，各引物浓度均为2uM；取连接纯化产物2ul作为模板进行PCR反应，反应体系20ul，包含10u1 2x HIFI PCR master mix，2u1 Pmix，2ul连接纯化产物，6ul无菌水；其PCR程序为:98℃2min；12x(98℃10s,60℃30s，72℃30s)；ho1d at 10℃；(5)最终产物illumina测序平台进行PE150模式测序，测序数据进行后续分析；(6)根据标签序列将测序的读序分到不同样本中，对目标位点或区域测序深度进行计数，分析目标区域的突变位点，同时计算目标区域基因拷贝数。
[0031]本实施例中使用的通用引物序列如下:[0032]接头通用引物F
[0033]TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAGAACGGAATGTGTACTTGC[0034]接头通用引物R
[0035]TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTCGCTAACAAGCTCAGCTA[0036]UNIPCRF
[0037]AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC[0038]UDIR0001
[0039]CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT AACCGCGG GTGACTGGAGTTCAGACGTG[0040]UDIR0002
[0041]CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT GGTTATAA GTGACTGGAGTTCAGACGTG[0042]UDIR0003
[0043]CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT CCAAGTCC GTGACTGGAGTTCAGACGTG[0044]三个阳性结果的检测结果见表2，表3及图2。[0045]表2各样本目标测序深度统计
[0046]
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[0048][0049]
表3各样本目标区域测序深度统计
转录本区域位置信息(hg38)突变信息NM_000053exon8chr13:51958356c.2310C>GNM_000053exon8chr13:51958333c.2333G>T三个阳性样本的检测结果与已知突变类型相符合。
突变类型杂合突变杂合突变
[0050]
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序列表<110> 苏州赛美科基因科技有限公司<120> 一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法<130> 2020.11.11<160> 116<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 1gtacttctac gttcaggcct acaaatct 28<210> 2<211> 26<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 2gagatttgtt tactgaagga gcagct 26<210> 3<211> 24<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 3tcctgtggac agtagtcctc tgaa 24<210> 4<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 4gcaatgcttg tggccagg 18<210> 5<211> 29<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 5caactcaaat aagtgtttat tcctcttgg 29<210> 6<211> 26
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<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 6cattcagaaa acaaacagag cacata 26<210> 7<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 7aattacccaa gttgcaaata tatgtgtt 28<210> 8<211> 21<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 8ttgctgacag aggcaaactc c 21<210> 9<211> 25<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 9atttgctctg ctcttcctac tcctt 25<210> 10<211> 21<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 10caagaggctt ccaaattgag g 21<210> 11<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 11tagactaagt tgctttcaag tgataattgc 30<210> 12<211> 34<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 12
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tgtttacttt actgagcgac tcttgaaaga tgat 34<210> 13<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 13tggataaagc ataatttgtc aagtctca 28<210> 14<211> 24<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 14
atgttgatcc attc 24gaagccagtc
<210> 15<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 15gggcattgat ggcaaatcat 20<210> 16<211> 30<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 16tctcttaaaa tgtttctgct acatttcagt 30<210> 17<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 17gaatgccttc tcttttgtct atatctga 28<210> 18<211> 31<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 18gcatatctac tctttttctg tacttcattg g 31<210> 19<211> 22
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<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 19aggtgtgtgt gtggcttcaa aa 22<210> 20<211> 30<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 20cagtaaaacc cactaatact tgaaggtcat 30<210> 21<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 21aaagaacttg aaagattcat ggtctcta 28<210> 22<211> 25<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 22ggggctttat ttgctttttg ctgta 25<210> 23<211> 25<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 23cggccttcac tatgtaaagg tcagt 25<210> 24<211> 25<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 24ttttgcttct cttacatgcc agttc 25<210> 25<211> 26<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 25
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aaaattactt cagcaaggcc atgtta 26<210> 26<211> 27<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 26agggagttct ccttgatcac ccatgat 27<210> 27<211> 24<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 27
gcactaacct gatt 24gggattgttt
<210> 28<211> 22<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 28tcagccctgc acattctgta ca 22<210> 29<211> 25<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 29cctggatcct ttattacgaa ttgtg 25<210> 30<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 30tgccttgctt catgcagtgt 20<210> 31<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 31ttgttatttg ttttaaacaa aagtgttagg 30<210> 32<211> 30
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<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 32agatccttct ttgataaagc attcttcata 30<210> 33<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 33aaataatctg attatttata accctgtttt 30<210> 34<211> 26<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 34agagcaactg agtaagtggc aagaaa 26<210> 35<211> 26<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 35ggtgtatctg gtgttgaaaa ttcgaa 26<210> 36<211> 30<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 36attaatctaa atttaaacgg agagtgttca 30<210> 37<211> 28<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 37gcaaccagtt acaagttaaa gaaatgtg 28<210> 38<211> 21<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 38
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gctctggagg acccaggtct g 21<210> 39<211> 32<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 39acatactcag tagacaacat aaagcctcat aa 32<210> 40<211> 28<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 40
atctctctat atttgcta 28caaacttgcc
<210> 41<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 41tcataaaata aaattgatta gtggcatctg 30<210> 42<211> 22<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 42agacgttgtc gtaagcaaag cc 22<210> 43<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 43ctggagcctt ttagaatttt atgtaaaaga 30<210> 44<211> 22<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 44ttcacactcc tggtgcatga ag 22<210> 45<211> 22
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序 列 表
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<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 45caccttaacc attgcaaacc ag 22<210> 46<211> 22<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 46ttcacactcc tggtgcatga ag 22<210> 47<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 47aaaatacgtt ttaaaacaac ttcatttgtg 30<210> 48<211> 28<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 48gctaaatcca gaaatacact cttccaaa 28<210> 49<211> 24<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 49gccaacaaca ccctctttat tgtc 24<210> 50<211> 26<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 50ccaaaaagtt ccttcagagt tccttc 26<210> 51<211> 26<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 51
16
CN 112522381 A
序 列 表
9/19页
ttttcattga ccatcacatg ctaata 26<210> 52<211> 31<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 52aaatatgtgc acaaaggaga tactagataa a 31<210> 53<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 53
aaaacatgtt attttccttc 30agagtgatta
<210> 54<211> 30<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 54cagatatgct atagtacaga aggcaaaaga 30<210> 55<211> 26<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 55ttttgtgcta aaactttgag tcccat 26<210> 56<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 56gctctaaggg agagcggacc 20<210> 57<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 57ttcaaaatga aacatggaac tttagaaatt 30<210> 58<211> 24
17
CN 112522381 A
序 列 表
10/19页
<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 58ctgtgactgt ttccaaggat gtca 24<210> 59<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 59ggtcattctc tcctggctcc 20<210> 60<211> 28<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 60atgatgtcat taagtgacct gttaccaa 28<210> 61<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 61tttatgtaca atatgtattc agagtatccc 30<210> 62<211> 22<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 62cttggttgca gggatggatt at 22<210> 63<211> 30<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 63caaaggtttt tataagttct gtggatcttt 30<210> 64<211> 28<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 64
18
CN 112522381 A
序 列 表
11/19页
gagaaccata aatatttggg agaagtga 28<210> 65<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 65cgagatgtgg ccctcgtt 18<210> 66<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 66
attgctgccc
acggagct 18<210> 67<211> 23<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 67catgagcctg tgtgtaagtc ctg 23<210> 68<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 68agcaaatcca gggagggtgt 20<210> 69<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 69aggactgcgt tttcacctcc 20<210> 70<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 70gagacgggga tacctggctg 20<210> 71<211> 18
19
CN 112522381 A
序 列 表
12/19页
<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 71cacgagcttg gctctggc 18<210> 72<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 72tgacgccctg agcctcat 18<210> 73<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 73tgcggggact tggcctcagc 20<210> 74<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 74ggaggcccag caggcaggtg 20<210> 75<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 75tagggtccag aaggccctgt 20<210> 76<211> 24<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 76gtcttttggg gaaaaaccct actg 24<210> 77<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 77
20
CN 112522381 A
ggctaccccg tgacctgg 18<210> 78<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 78atgtggggcc tacctggg 18<210> 79<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 79
ggctgcctct
gctgcaag 18<210> 80<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 80ggggactcac tggacaggaa 20<210> 81<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 81tctcagccac agccagca 18<210> 82<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 82ccctcaaagc caggaaggag 20<210> 83<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 83cttcagaggc gctgcacg 18<210> 84<211> 18
序 列 表
13/19页
21
CN 112522381 A
<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 84ttctgccgca aggcctag 18<210> 85<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 85tgtttccctg ctgccagg 18<210> 86<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 86acagccaagg gcaaagca 18<210> 87<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 87ttgccacccc tcactgtctg 20<210> 88<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 88accccacacc gactccag 18<210> 89<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 89gggagctggg ctctctgg 18<210> 90<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 90
序 列 表
14/19页
22
CN 112522381 A
序 列 表
15/19页
ccaagctcca gggtccgt 18<210> 91<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 91acctggcacc ctgaccct 18<210> 92<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 92
tgtagtgccg
cctggacc 18<210> 93<211> 22<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 93tcttctccaa cttcacggct gt 22<210> 94<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 94aggaaggtgc agtcacctcg 20<210> 95<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 95ctggactcgg gggagctg 18<210> 96<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 96aggctcaccc gacatggaac 20<210> 97<211> 20
23
CN 112522381 A
序 列 表
16/19页
<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 97cgcctgccag cctcgacacc 20<210> 98<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 98gagggagccc cggtgcctgt 20<210> 99<211> 22<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 99ggtaagtggt ggtcaccagt cc 22<210> 100<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 100cacataggcc gccaggtt 18<210> 101<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 101agaaggcctc agctggca 18<210> 102<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 102ccccaaatat cccaagaggg 20<210> 103<211> 22<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 103
24
CN 112522381 A
序 列 表
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gatgggtaag gggaggtact gg 22<210> 104<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 104tgccactcac ctgtgttgga 20<210> 105<211> 22<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 105
agccctgtac
aagtcactgt cg 22<210> 106<211> 18<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 106gcttcctgag cagggcag 18<210> 107<211> 20<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 107gtagcccctc ctcctgctga 20<210> 108<211> 20<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 108tggccaagcc aaagacattc 20<210> 109<211> 18<212> DNA<213> 正链探针(FP)<400> 109ccagccccac atccagca 18<210> 110<211> 18
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CN 112522381 A
序 列 表
18/19页
<212> DNA<213> 负链探针(ＲP)<400> 110agagccctgc ctccccta 18<210> 111<211> 45<212> DNA<213> 接头通用引物(R)<400> 111tcagacgtgt gctcttccga tctctctcgc taacaagctc agcta 45<210> 112<211> 45<212> DNA<213> UNIPCRF<400> 112aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45<210> 113<211> 52<212> DNA<213> UDIR0001<400> 113caagcagaag acggcatacg agataaccgc gggtgactgg agttcagacg tg 52<210> 114<211> 52<212> DNA<213> UDIR0002<400> 114caagcagaag acggcatacg agatggttat aagtgactgg agttcagacg tg 52<210> 115<211> 52<212> DNA<213> UDIR0003<400> 115caagcagaag acggcatacg agatccaagt ccgtgactgg agttcagacg tg 52<210> 116<211> 45<212> DNA<213> 接头通用引物(Ｆ)<400> 116
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CN 112522381 A
序 列 表
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tcagacgtgt gctcttccga tctcaagaac ggaatgtgta cttgc 45
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CN 112522381 A
说 明 书 附 图
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图1
图2
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