拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其脂质体含量的测定

新释药系统北京市重点实验室副主任，中国药学会药剂专业委员会副主任委员，

中国颗粒学会常务理事、生物颗粒专业委员会副主任委员，《北京大学学报（医学

版）》、《中国药学杂志》、《中国新药杂志》、《中国药学（英文版）》、Asian Journal of

Pharmaceutical Sciences、Precisiof Nanomedici#$、BioMed Research Internatiofal 等 国

内外学术期刊编委。吕万良教授针对以乳腺癌、脑肿瘤、肺癌等为代表的肿瘤和肿瘤干细胞进行

了持续性研究，在肿瘤细胞转运体、肿瘤干细胞、肿瘤线粒体及内源性耐药基因、

乳腺癌拟态血管作用机制及其功能靶向性给药系统的研究方面取得了重要进展。

作为课题负责人，先后主持了国家高技术研究发展计划#863计划）、国家重点基

础研究发展计划（973计划）、国家自然科学基金、北京市自然科学基金重点项目等纵向课题20余项，获新药

证书 1 项和临床批件 4 项° 研究成果在 Advanced Drug Delivery Redes、BiomaOdale、Journal of Controlled Re- lease、Clinical Pharmacology & Therapeutice等学科顶尖学术期刊上发表论文160余篇，在国内外学术界产生了

重要影响，有关论文在美国《科学引文索引》数据库（Sciencc Citation Index，SCI）中被列为高被引论文。连续

入选2014—2018年度Elsevier发布的在国际具有重要学术影响力的高被引中国学者榜单，研究成果分别获 得了 2009年度教育部自然科学奖一等奖（第1完成人）、2012年度教育部自然科学奖一等奖（第2完成人）、

2018年度北京市科学技术奖二等奖（第2完成人）等。拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其 脂质体含量的测定李雪琦1,李建伟1 $2'3$4，李秋红Z,阎 妍1,段嘉伦1,崔一诺1,苏展博1,罗 倩1,许佳瑞1,杜亚菲1,王桂玲】，谢英1，吕万良仏（1.天然药物与仿生药物国家重点实验室，分子药剂学与新释药系统北京市重点实验室，北京大学药学院，北京

100191 ； 2.北京大学前沿交叉学科研究院，北京100871 ； 3.山西振东制药股份有限公司制剂所，山西长治

047100； 4.山西大学中医药现代研究中心，太原030006）［摘 要］目的：拉洛他赛是国内外均未上市的新结构药物，未见质量研究相关报道。对拉洛他赛进行波谱解析

以验证其分子式、相对分子质量和化学结构式,同时建立一种定量方法用于拉洛他赛脂质体制剂的含量测定。方

法：利用质谱、红外吸收光谱、核磁共振波谱测定方法,对拉洛他赛进行药物结构和光谱学解析;利用紫外-可见分光

光度法对拉洛他赛进行全波长扫描，确定其吸收波长;利用高效液相色谱法，建立拉洛他赛定量方法并用于脂质体 拉洛他赛包封率的测定。结果：揭示了拉洛他赛的四大光谱学特征并制订相应的标准图谱。确认了拉洛他赛的结

构为三环二萜,分子式为C45H53NO14，相对分子质量为831.900 1。建立了拉洛他赛的高效液相色谱定量方法，其色 谱柱为C18硅胶反相色谱柱（5 #叫250 mmx4.6 mm），流动相为乙腈冰（体积比75 : 25 ），检测波长为230 nm， 该方法可用于测定脂质体制剂中拉洛他赛的包封率，稳定性、回收率和精密度高。此外，新制备了拉洛他赛脂质 体，该脂质体粒径大约105 nm,均一性良好，药物包封率大于80%。结论:制订了拉洛他赛的质谱、红外吸收光谱、

核磁共振波谱和紫外-可见光谱图谱，验证了拉洛他赛的分子式、相对分子质量和结构式，建立了拉洛他赛的高效 液相色谱定量方法，该方法可用于拉洛他赛脂质体的质量控制。基金项目：国家\"重大新药创制\"科技重大专项基金(2018ZX09301-018-004 ) Supported by the Nationai Key Grant for New Drug Innovation

(2018ZX09301-018-004)△ Corresponding author & s e-maii，luwl@ bjmu. edu. cn网络出版时间：2019-5-17 9 ：14 ：36 网络出版地址：http：//kns. enki. net/kcms/detail/11.4691. R. 20190516. 1007. 006. htmi北京大学学报(医学版)・468・［关键词］拉洛他赛;波谱解析;高效液相色谱法JOURNAL OF Peking university! HEALTH sciences) Vol. 51 No. 3 Jun. 2019［中图分类号］R927 ［文献标志码］A ［文章编号］1671-167X(2019)03-0467-10doi：10.19723/j.issn. 1671-167X. 2019.03.014Spectrometric analyses of larotaxel and larotaxel liposomes quantification by high performance liquid chromatographyLI Xue-qO , LI Jian-wei1,2,3,4 , LI Qiu-hong1,4 , YAN Yan1 , DUAN Jia-lun1 , CUI Yi-nuc1 , SU Zhan-bc1 , LUO Qian1 , XU Jiacui1 , DU Ya-fei1 , WANG Gui-ling1 , XV Ying1 , LU Wan-liang1A(1. State Key Laboratora of Natural and Biomimetic Drugs, Beijing Key Laboratora of Molecular Pharmaceutics and New Drug System, Peking Universita School of Pharmaceutical Sciences, Beijing 100191, China； 2. Academy for Advanced In- terdiscipUnary Studies, Peking University, Beijing 100871 , China； 3. Shanxi Zhendong Pharmaceutical Co. , Lth.,Changzhi 047100, Shanxi, China； 4. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)ABSTRACT Objective: Larotaxel is a new chemical structure drug, which has not ben marketed woVU-wide. Accordingly, tha sindsd identification and quantification methods foc kirotaxel remain unclevc. The spectrometric anlysvs were performed for verifying weight molecular formula, molecular weight and chemical structure of larotaxel. Besides, a quantification method was developed for 1X16—11100 larotaxel in the liposomes. Methods: Tho molecular formula, molecular weight and chemical structure of iarotaxei were studied by using mass spectrometry ( MS) , infrv-red (IR), nuclear maantic resonant ( NMR) and uUraviolet-visibia ( UV-vis) speiometric technique. Tha absorphon wavvUngth of larotaxel was in- vstigated by UV-vis spectrophotometry fulUwayvUngth scanning. BesiOes, a quantification method was developed by high performanc liquid chromatocraphy ( HPLC ) , and then elidaed by measuring the en- capsuition ficaca of larotaxel liposomes. Results: The four spectral 01x0—3-0 of larotaxel were re­vealed and tha corresponding standard spectra were defined. It was conirmed that krotaxei had tha struc- tura of tricyclic diterpenods, with tha molecular formula of C45H53NO14 , tha molecular weight of 831.900 1, and tha maximum absorption wavelength of 230 nm. Tha quantitative method of larotaxel was established by using HPLC with a reversed phase C18 column (5 #m, 250 mm X 4. 6 mm) , a mobile phase of adto- nitriU-wLf (75 : 25, volume/volume) , and a detection wdiUngth of 230 nm. Tha vvlidation study ee- hibited that the established HPLC method was stable, and had a high recovery and precision in tha quan- titativv measurement of larotaxel in liposomes. In addition, a new kind of larotaxel Uposomas was also successfully prepared. Tha partick siza of tha Uposomas was about 105 nm, with an even siza distribu­tion. And tha encapsulation /ficiency of larotaxel in the Uposomas was above 80% . Conclusion: Thapres/it study offers reference standard spectra of larotaxel, induding MS, IR, NMR, and UV-vis, and conoiom themoaecuaaoooomuaa, moaecu aoweightand chemicastouctuoeooaaootaeea.Besides, thestudy develops a rapid HPLC method for quality control of larotaxel liposomes.KEY WORDS Larotaxel; Spectrometric antysis ； High performance liquid chromatographc拉洛他赛！ larotaxel, XRP9881, RPR109881)最

初是由Sanofi-Wventis公司开发的通过半合成方法

得到的一种新型的紫杉烷类细胞周期特异性化疗 药,具有较广的抑瘤谱。目前为止，该药在国内外均 未上市，我国山西振东药业正在进行拉洛他赛脂质

治疗转移性乳腺癌的疗效优于多西他赛和多柔比 星［8-10］^星

有文献报道显示，国外用于临床试验的拉洛他

O赛制剂中,一般加入表面聚山梨酯作为增溶剂，以增 加拉洛他赛的溶解度［11］，例如Sanofi-Aventis公司在

用于二期临床试验的拉洛他赛注射剂中采用了聚山 梨酯(吐温-80)作为增溶剂。为避免采用表面活性 剂可能导致的患者过敏，增强拉洛他赛对肿瘤组织

微球注射剂的新药开发，并获得了国家食品药品监

督管理局批准，目前正开展临床试验研究。与其他紫杉烷类化疗药相似,拉洛他赛可作用

于细胞分裂过程中纺锤体微管蛋白，与游离的微管

蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定微管并抑制微 的被动靶向性聚集，本课题组研究了一种拉洛他赛 脂质体［I2］O为了对拉洛他赛及其脂质体制剂进行全面的定

管解聚，从而抑制癌细胞的有丝分裂。初步研究显 示,拉洛他赛区别于其他紫杉烷类抗肿瘤药,其可杀

伤耐药性癌细胞，还可透过血脑屏障，表现出很好的

性和定量表征，本研究采用红外吸收光谱、核磁共振

波谱(nucle/r magnetic resonance spectroscopy, NMR)、质谱和紫外光谱,对拉洛他赛的分子结构进

抗肿瘤应用前景体外研究表明，拉洛他赛的

抗肿瘤活性强于紫杉醇，对多药耐药性肿瘤细胞展 现出较强的抑制和杀伤作用［5-7］.现有的临床研究

结果表明,拉洛他赛作为二线治疗或补救治疗药物,

行了光谱学解析，同时建立一种采用高效液相色谱

(high performance liquid chromatography, HPLC )对拉

洛他赛进行含量测定的方法，为建立拉洛他赛制剂

李雪琦,等拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其脂质体含量的测定-469 -的质量标准提供依据。1材料与方法1 -1实验材料correlation） , HMBC （ heteronuclear multipi bond cor- eaaison） 和 DEPT（ dssioisonaesenhanoed poaaseaison

transfer）135光谱。核磁化学位移为：CDCI3 （ TMS,

1H NMR3 0.00, 13C NMR # 0.0 ppm,ppm 为百万分

拉洛他赛（larotaxeo和拉洛他赛对照品（纯度: 99.8%）由山西振东制药有限公司提供，氘代氯仿

之一相对化学位移）.1 -3.4紫外吸收光谱测定 取适量0.25 g/的拉

购自北京百灵威科技有限公司，甲醇（HPLC级）和 洛他赛标准溶液，在200 -800 nm波长范围内进行

乙月青（HPLC级）购自Burdick & Jackson公司（美 光谱扫描。1.4拉洛他赛高效液相色谱法的建立1 -4.1 色谱条件 色谱柱为SB-C18柱（5 #m,

国），二棕榈酰磷脂酰胆碱（1,2-dipal/imyl-sn-glyca-

re-3-phosphocholina, DPPC ）、二硬脂酰磷脂酰乙醇

胺-聚乙二醇（distexroylphosphatidyt ethanolamine-po- lyethylene glycoi, DSPE-PEG2000 ）购自 Avanti 公司

（美国），胆固醇购自北京市海淀区微生物培养基制

品厂，其余试剂均为分析纯，购自北京国药试剂公

司。1.2实验仪器BT-25S精密电子天平（十万分之一）购自德国

Sartorius公司,安捷伦1260型高效液相色谱仪购自 Agilent公司（美国），ZORBAX SB-18反相色谱柱

（Agilent，5 #m，4. 6 mm X 250 mm）购 自 Agilent 公

司（美国），红外光谱仪（Nexus 470）购自Nicolet公 司（美国），核磁共振波谱仪（Avance III 400）购自 Brukar公司（德国），高分辨质谱（Xeva G2 Q-TOF）

购自Water公司（英国），紫外可见分光光度计

（UV-1800型）购自上海美谱达仪器有限公司，

RE52CS旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂,SB 5200超声机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，

JY92-IID型超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科 技股份有限公司，激光散射粒径测定仪（Malvern zetasizer 3000HS）购自Malvern公司（英国），透射电

镜（Tecnar G2 20 ST型,TEM）购自FEI公司（美国）。

1 -3拉洛他赛的四大光谱测定1 -3. 1质谱测定采用单四级杆质谱仪（quadru-

poie mass spectrometer）,以甲醇作为液相基质对拉

洛他赛进行检测。1 -3.2红外吸收光谱测定 采用KBr压片法将拉

洛他赛固体粉末进行压片，然后检测。分辨率为

4.00，采样增益为1.0,动镜速度为0.474 7，光阑为

100.00，检测器为DTGS KBr,分束器为KBr,光源为

红外光源。1 -3.3核磁共振谱测定 将10.0 mg拉洛他赛溶

于0.5 mL CDCI3,然后置于核磁管进行检测，检测

温度恒定为25 P.核磁共振谱包括JH NMR,13C NMR, 1H-1H COSY（ 1 H-1 H chemicai-shift correlation spectroscopy） , HSQC （ heteronuclear singia quantum

250 mmx4.6 mm）,测定温度为25 °C,流动相为乙

腈水（体积比为75 : 25）,流速为1.0 mL/mic,进样 量为10 #L,检测波长为230 nm.1.4.2标准曲线 精密称取拉洛他赛对照品适量,

加入甲醇溶解，制备200.0 mg//的拉洛他赛贮备

液,并倍比稀释成 0- 5/1-5/3-0/6- 0/12- 0/25-0、

50.0/100.0 mg//系列浓度的拉洛他赛溶液样品。

按照上述色谱条件,取不同浓度的溶液分别进样，用

高效液相色谱仪检测每一浓度的峰面积A值,并以

浓度C为自变量,对相应的色谱峰面积A进行线性 回归,求得拉洛他赛的标准曲线。1 -4.3稳定性 精密称取拉洛他赛对照品适量，加

入甲醇溶解，制备成5.0/10.0和25.0 mg/L溶液,

于制备后0/2 /4 /6/8 h分别用上述色谱条件测定峰

面积，平行测定3次，取其平均值并计算相对标准偏

差。1 -4.4回收率 取适量的空白脂质体，加入9倍体

积的甲醇使脂质体破坏和溶解，加入精密称定的拉

洛他赛对照品溶液适量，以甲醇为溶剂，配制成

5.0/10.0和25.0 mg/L溶液各3份,分别用上述色

谱条件测定峰面积,计算回收率和相对标准偏差.1 -4.5精密度 取适量的空白脂质体，加入9倍体

积的甲醇使脂质体破坏和溶解，加入精密称定的拉

洛他赛对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成5.0/ 10-0和25.0 mg/L拉洛他赛的系列浓度溶液，于5 d

内分别用上述色谱条件测定峰面积，计算日内和日

间相对标准偏差。1 -4.6检测限精密称定的拉洛他赛对照品适

量，加甲醇溶解并稀释，按倍比配制系列浓度，分别 按照上述色谱条件测定样品的色谱峰，当信噪比约 为3 : 1时，其检测浓度被认为是本方法的检测限。1 -5拉洛他赛脂质体的制备与表征1 -5.1拉洛他赛脂质体的制备 精密称取DPPC/

胆固醇/DSPE-PEG2000 （60 ： 40 ： 5, #mo/#mol）和

拉洛他赛（质量比为药：脂材=1 ： 20）置于茄形瓶

北京大学学报（医学版）-470 -JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES） Vol. 51 No. 3 Jun. 2019中,加入适量氯仿：甲醇!体积比为3 : 1 )溶液溶 解,然后在40 p水浴减压蒸发除去有机试剂，在瓶 底和内壁形成一层均匀的脂膜。加入适量磷酸盐缓 冲液(pH 6. 8 )水化，先在水浴中超声2 ~ 3 min,形

谱见图1B,结果显示，测得m/z 876.345 4为［M +

2Na-H］-(计算值为 876- 335 8) ,m/z 830- 339 0

为［M-H］-(计算值为830. 408 0).根据两种模 式下的质谱结果，可确定其分子式为C5H53NOM，其

成乳白色均匀的粗脂质体，然后转移到超声波细胞

粉碎机中进行探头超声,设置超声工作时间为1 S,

相对分子质量为831.900 1.2.2拉洛他赛的红外吸收光谱测定结果间歇时间为1 s,全程时间为10 mb,保护温度为 35 P,功率为200 W.探头超声结束后，形成带有

拉洛他赛的红外吸收光谱见图2,结果显示，在 波数3 439.37 cm'1处存在较尖锐的吸收峰,推测为

O—H伸缩振动，表明存在多个羟基,3 000 cm'1左

弱蓝色乳光的半透明液体，再将所得脂质体依次挤 压通过孔径为400 nm、200 nm的聚碳酸酯膜，各挤

右的吸收可见苯环的C—C伸缩振动，2 975- 80 压过膜3次即得到拉洛他赛脂质体。1 -5.2空白脂质体的制备与拉洛他赛脂质体的

制备方法相同，但在成膜过程中不加入拉洛他赛。1 -5.3拉洛他赛脂质体的形态观察以去离子水

作为分散介质，适当稀释拉洛他赛脂质体,将稀释后 的拉洛他赛脂质体液再经200 nm的微孔滤膜过滤，

然后将铺有碳膜的铜网漂放在脂质体溶液上,1 mm 后取出用滤纸吸干，将俘获有脂质体粒子的铜网漂

放在1%(体积分数)醋酸双氧铀水溶液上,1 min后

取出用滤纸吸干，静置过夜，置于透射电镜下观察。1 -5 - 4拉洛他赛脂质体粒径和Zeta电位的测定

取新制得的拉洛他赛脂质体各1 mL,加磷酸盐缓冲

溶液(pH 6.8)适当稀释,利用激光散射粒径测定仪测

定。测定温度设定为25 P ,每个样品测定20次，记

录其粒径、多分散系数和Z/a电位值并计算平均值。1 -5.5拉洛他赛在脂质体中包封率的测定取新

制备的拉洛他赛脂质体500 #L,使之通过Sephadev

G-0葡聚糖凝胶柱,以磷酸盐缓冲溶液(pH6. 8)为

流动相，分离未包封于脂质体的游离拉洛他赛,收集 分离后的脂质体,加甲醇破坏,然后用高效液相色谱 法进行测定。另外,取未过凝胶柱的拉洛他赛脂质

体,适当稀释后加入流动相破坏，然后用上述高效液

相色谱法进行测定。拉洛他赛在脂质体中的包封率 用以下公式计算:包封率=过凝胶柱脂质体中测得

拉洛他赛量/未过凝胶柱脂质体中测得拉洛他赛 量X100% .按照外标法,平行测定拉洛他赛对照溶

液中的药物量作为参比标准，计算拉洛他赛在脂质

体中的包封率。2结果2.1拉洛他赛的质谱测定结果拉洛他赛的正离子模式高分辨质谱见图1A,结 果显示，测得m/z 854.336 6为［M+Na］ + (计算值 为 854. 335 8) ,m/z 832- 354 9 为［M+H］ + (计算

值为832.408 0)。拉洛他赛的负离子模式高分辨质

cm\"处存在一CH3伸缩振动，2 925- 71 cm\"和 2 850.49 cm\"处为一CH2—伸缩振动，1 719- 39

cm'1处的吸收峰为C = O伸缩振动,表明存在多个

酯羰基,1 637.03 cm'1处出现酰胺的C = O伸缩振

动，表明存在酰胺结构,1 500 -1 400 cm'1区域为苯

环的骨架振动，1 369.74 cm'1为一CH对称弯曲振

动,提示有叔丁基的存在，1 245.15 cm'1处最强的

吸收峰为C—O伸缩振动，表明结构式中存在多个

C—0单键。综合以上结果，可推测出拉洛他赛结

构中存在多个羟基、苯环结构、多个酯基、酰胺结构

及叔丁基结构，进一步验证了拉洛他赛的化学结构。

2. 3 拉洛他赛的核磁共振光谱测定结果拉洛他赛的核磁共振碳谱和氢谱分别见图3A、 3B.拉洛他赛的二维核磁共振谱分别见图4ACH-

1H COSY)、4B ( HSQC ) / 4C ( HMBC)和 4D ( DEPT

135).拉洛他赛的一维核磁共振谱中共出现45个碳

信号和53个质子信号，其中719为拉洛他赛的特

征结构，其化学位移为15.63,所对应的两个质子的 化学位移分别为 2.25 (1H, m)、1.66 (1H, t, J =

5.8 Hz)。拉洛他赛的二维核磁共振谱结果显示,1h-1h COSY二维谱可以见到相耦合的质子相关信号,

HSQC二维谱中可见到各个碳与相应质子的相关信

号,HMBC二维谱中可见各个碳与相邻质子的相关

信号,DEPT 135二维谱所得碳的分类与结构式基本

一致，共8个CH、4个CH2、18个CH和15个季碳。经 1H-1H COSY、HSQC、HMBC 和 DEPT 二维波 谱验证「H NMR (400 MHz, CDCf )和13 C NMR

(125 MHz,CDCf)波谱提供的质子信号和碳信号全

部进行归属⑴］，详细结果见表1,化学结构见图5。综合上述一维及二维NMR谱所给出的信号, 可以给全部碳、氢信号做出正确归属,证实拉洛他赛

的化学结构式准确无误,相应的，本研究所测定绘制

的谱可望作为拉洛他赛参考标准核磁共振波谱。李雪琦，等 拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其脂质体含量的测定• 471 •A

854.336 65040832.354 9855.340 030d833.357 7849.379 8856.342 4严 294 3 776當：7

770

814.343 9-815.346 31严366j 813 353 比芽盟834.360 2f5-363 9840

mlz1850

「……

860

857.345 0 Q72 346 41*886 9罗2.363 4

5780 790 800 810 820830 870 880 890 900 910876.345 490­80-70-60-50-40-877.348 6893.336 230-894.339 320-10-0[94.J6 打 802.246 9 816.313 4878.352 1830.339 0831.343 0832.344 8780 790 800 810 820 830 840

866.315 4850.351 1,854.316 . >5 ... | .. | 4iJ .'.'.879.356 5944.333 3895.342 8945.337 3f 920 353 1 928.313 2；31 豎」L[hTmmk.930850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950mlzA, positive ion mode； B, neeativa ion mode.

图1拉洛他赛的高分辨飞行时间质谱图Figure 1 Mass spectrums ot larotaxer by quadrupole-time ot tight mass spectrometre ( Q-TOF-MS)七

上

s.SIUSURIH寸

I69.IE4 000 3 500 3 000 2 500

2 000 1 500Wave numbers/cm_11 000500图2拉洛他赛的红外吸收光谱Figurr 2 Infra-red absorption spectrum ot larotaxer北京大学学报（医学版）• 472 -JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES） Vol. 51 No. 3 Jun. 2019A, 13 C NMR spectrum of larotaxel； B, 1 H NMR spectrum of larotaxel. NMR, nuclear magnetic resonance ； ppm, one millionth chemical shift.

图3拉洛他赛的核磁共振碳谱及氢谱Figure 3 13 C NMR and 1 H NMR spectrums ot larotaxel2.4拉洛他赛的紫外-可见吸收光谱扫描结果处吸收信号很弱，在随后波长的紫外和可见区拉洛

当拉洛他赛甲醇溶液为0. 25 g/L时，将该溶液

在200〜800 nm波长范围内进行光谱扫描,得到拉

他赛没有吸收值。2 - 5拉洛他赛的高效液相色谱测定方法洛他赛的紫外-可见吸收光谱图(图6).根据其吸

收光谱可知，拉洛他赛在203 nm处有最大吸收，在 230 nm附近有较强的紫外吸收信号，但是250 nm

2.5.1标准曲线按照上述色谱条件，测定系列浓

度的拉洛他赛溶液样品的色谱峰面积'值,并以浓 度C( m/L)为自变量，对其相应的色谱峰面积'值

李雪琦，等 拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其脂质体含量的测定• 473 •进行线性回归，求得标准曲线（图7A）。拉洛他赛 5.0、10.0和25.0 m/L的拉洛他赛甲醇溶液分别

的标准曲线为' = 11.82C +0.01,8 二 0.999 9,具 有很好的线性关系。拉洛他赛在此液相条件下的标

在0、2、4、6/8 h时测定峰面积（表2）,结果表明，拉 洛他赛在8 h内测定结果基本稳定，相对标准偏差 （relative standard deviation, RSD ）值小于 2. 0% o 由

准色谱图见图7B,拉洛他赛色谱峰的保留时间为

5.71 mb左右，峰型规整、对称。2.5.2

此可知，拉洛他赛的甲醇溶液在8 h内具有较好的

稳定性，进行含量测定时无需新鲜配制。稳定性按照上述色谱条件，对浓度为AB'1.02345678910020406080gd

10012014010

D710 9876543210f2/ppmC9876543210f2/ppm020406080 | 100 M 120 U14016018020010

9876543210f2/ppm190 170 150 130 110 90 70

fl/ppm50 30 10 -10A,1H-1 H chemical correlation NMR ( 1 H-1 H COSY) spectrum； B , 1 H detected heteronucleae sin/ulae quantum correlation ( HSQC) NMR spectrum； C , 1 H detected heteronuclear multiple bond correlation ( HMBC ) NMR spectrum ； D, distortionless enhanced polarization transfer ( DEPT) 135 NMR spectrum. NMR, (1016X0 ma/netic resonance； ppm, one millionth chemical shift.图4拉洛他赛的二维核磁共振谱Figure 4 2D-NMR spectrums of larotaxel图6 拉洛他赛甲醇溶液(250 m/L )在200〜800 nm

图5拉洛他赛的结构式和相对分子质量波长范围内的紫外吸收扫描光谱Figure 5 The structural formula and the relativemolecular mass ot larotaxelFigure 6 Ultra-violet visible spectrophotometric scannin/ spectrum of

larotaxel methanol solution (250 m/L) in the ran/e of 200 - 800 nm北京大学学报(医学版)• 474 -JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES) Vo/ 51 No. 3 Jun. 2019表1拉洛他赛的13C NMR和1H NMR波谱解析数据Table 11 H NMRand 13 C NMR a s ognmen is lo raa ro ia ee a

LaroiaeeaPosoion13C1H179.40280.065.68 (1H, d, J = 7.7 He)338.564.07 (1H, d, J = 7.7 He)479.60584.864.75 (1H, d, J = 3.3 He)626.062.46 (1H, dt, J = 16.1, 4.4 He)732.041.38 (1H, m)835.129201.791075.696.35 (1H, s)11133.6312140.401372.176.29 (1H, t, J = 8.4 He)1435.862.40 (1H, m) 2.23 (1H, m)1542.921626.061.28 (3H, s)1721.481.30 (3H, s)1814.591.87 (3H, s)1915.632.25 (1H, m)1.66 (1H, t, J = 5.8 He)2075.434 32 ( 1 , d, 8 8 )4.03 (1H, d, J = 8.8 He)1，172-80273.744.63 (1H,br. s)3，56.005.32 (1H, d, J = 8.8 He)4，138.505, 9，126.617.39 (2H, d, J = 7.0 He)6, 8，128.887.35 (2H, t, J = 7.0 He)7，128.047.33 (1H, t, J = 7.0 He)10，155.2011，80.1011z-( CH3) 328.121.28 (9H, s)r，167.492〃129.263\〃130.308. 16 (2H, d, JOT- He)4\，128.737.51 (2H, t, JOT- He)5〃133.637.61 (1H, t, J = 7- He)4-OAc22.26,169.702.45 (3H, s)10-OAc20.87,169.642.27 (3H, s)1-OH2.07 (1H, s):乂日3.31 (lH,br.s)3'-NH5.39 (1H, bed, J = 9.5 He)s, songaei； d, doubaei； i, iropaei； m, muaiopaei； di, douba iropai； br. s, broad singlet； br. d, broad doublet. NMR, nuclear magnetic reso­nance-A

2

(2u-

lY= 11.82X+0.01u 二•1R? = 0.999 9

V旦1

0

50 100 150 200B

二

Concentration of larotaxel/(mg/L)VEAEUms105.713

lEQPnQUIH1.731<----Larotaxel 2 4 6 8 10 12c

二

VEAEUmsColumn: SB-C18 (5 #m, 250 mmx4.6 mm) ； mobiie phase: acetoni­trile-Tater (75 : 25 , volume/volume )； detection wavelength: 230 nm.A, correlation profiie betreen concentration and peak area values of laro-u d b HPLC-UV meihod； B, iypsaaohrm iogram olaar-taxet measured by HPLC-TV spectrum ； C, chromatogram of limit of quanisiaisn olaaroiaeeameasured byHPLC.UV, uairaasoaei； HPLC, hsgh perlormanoeasqusd ohromaiography.图7高效液相-紫外色谱法测定拉洛他赛的浓度与

色谱峰面积相关曲线及典型色谱图Figurr 7 Correlation profile betoeen concentration and peak area values

of larotaxel measured by HPLC-UV method and typical chromatographs2.5.3回收率 使用上述色谱条件对3份浓度分

别为5-0/10. 0和25- 0 mg/L的拉洛他赛溶液进行 测定(表3)，结果表明,拉洛他赛对照品的回收率为

100% ±2% ,RSD值均小于1% ,脂质体制剂中拉洛

他赛的回收率为100% ±3% , RSD值均小于2%.

此含量测定方法对拉洛他赛对照品和脂质体制剂中 的拉洛他赛均具有很好的准确性。2.5.4精密度 使用上述色谱条件，于5 d内对5

份浓度分别为5-0/10. 0和25- 0 mg/L溶液进行测

定(表4),数据显示，拉洛他赛对照品的精密度为

100% ±5% ,RSD值均小于2% ,脂质体制剂中拉洛

他赛的精密度为100% ± 5% , RSD值均小于2%。

此含量测定方法对拉洛他赛对照品和脂质体制剂中 的拉洛他赛含量测定均具有较好的精密度。2.5.5检测限 采用高效液相色谱法测量拉洛他

赛的检测限约为50.0 #g/L,在检测限时的色谱图

见图7C.2 - 6拉洛他赛脂质体的制备与表征结果

李雪琦,等拉洛他赛的波谱解析及高效液相色谱法对其脂质体含量的测定-475 -制备的拉洛他赛脂质体带有微弱淡蓝色乳光,

其透射电镜图显示,该脂质体呈圆球形的囊状结构

激光粒度仪分析结果显示(表5),拉洛他赛脂质

体的平均粒径为(105.73 ±2.30) nm,多分散系数为 0.190 ± 0.072,zeta 电位为(0.240 ±0.015) mV.(图8)。在该脂质体中，由于拉洛他赛是脂溶性药 物,与脂质体膜材一起溶解然后成膜,故拉洛他赛被 包载于磷脂双分子层中。Table 2Concentration,/ (m/L)高效液相色谱法测定该脂质体中拉洛他赛的包 封率为 87.73% ±2.70%。表2拉洛他赛甲醇溶液HPLC-UV测定时的稳定性HPLC-UVmeasueementstabiaityolaaeotaeeain methanoaPeak area/ ( mAU •min)0h59.1 ±0.02h4hRSDL%6h8h5.010.059.1 ±0.1118.2±0.159- 1 ±0.0118.2±0.059.1 ±0.1118.2±0.159.1 ±0.1118.2±0.21.225.0118.2±0.1295.5 ±0.21.91.7295.5±0.1295.5 ±0.1295.5 ±0.2295.5 ±0.1Data are presented as the mean 土 standard deviation ( % = 3) - UV , ultraviolet ； HPLC, hi/h performance liquid chromato/raphy ； RSD, relative stan­dard deviation.表3拉洛他赛对照品及脂质体中用高效液相-紫外色谱法进行拉洛他赛含量测定的回收率Table 3 Reccveries of standard larotaxel and larotaxel in the liposomes measured by HPLC-UVSubstancesConcentration/(m/L)5.0Recovery/ %99. 62 ±0.3999.17±0.10RSDL%Laeotaeea10.510.330.1610.025.0101.34±0.0798.07±0.93Laeotaeea25.01.210.030.1410.025.099.61 ±0.06102.68 ±0.151 , reccveries of standard larotaxel; 2, reccveries of larotaxel in the liposomes. Data are presented as the mean 土 standard deviation (% = 3) - Abbre- iiationsasin Tabae2B表4拉洛他赛对照品及脂质体中用高效液相-紫外色谱法进行拉洛他赛含量测定的精密度Table 4 Precisions of standard larotaxel and larotaxel in the liposomes measured by HPLC-UVConcentraLon added/(m/L)Intra-day ( % - 5)Peecision L%gntee-da_( % -5 )RSDL%1.26Peecision L%RSDL%2.0110.0150.0199.23 ±0.4999.69±0.2298.89±0.4398.00 ±1.0598.02±2.761.371.200.310.2598.32±2.030.751.732.0298.41 ±1.4999.70±0.8399.64±0.331.430.0998.03 ±2.0310.0250.0298.11 ±1.7698.23 ±1.531.021.390.121 , reccveries of standard larotaxel; 2, reccveries of larotaxel in the liposomes. Data are presented as the mean 土 standard deviation (% - 5) - Abbre- eiationsasin Tabae2B表5拉洛他赛脂质体的理化表征Table 5 Physicochemical characterization of larotaxel liposomesFoemuaationsParticle size/nm82-13 ±1.94105.73 ±2.30PDIZeta potential/mV0.25 ±0.01Encapsuaation eliciencyL%87.73 ±2.70Baank aiposomesLaeotaeeaaiposomes0.131 ±0.0320.190±0.0720.24 ±0.02Data are presented asthemean ±standaed deeiation( % -3 ) .PD3, poaymeedispeesityindee.3讨论的四大光谱图可作为拉洛他赛的参考标准图谱，用

作其药物研究、药品鉴定、药品开发检验和生产质量

鉴于拉洛他赛在抗耐药性和转移性乳腺癌方面 控制等。在正离子模式下的高分辨质谱图中,拉洛他赛

的药效学优势，目前国内外都在积极开展临床试验 研究。本研究利用高分辨质谱、红外吸收光谱、核磁

呈现两个强信号峰，分别为5/z 854- 336 6和m/z

832.354 9,分别对应[M+Na] +和[M +H] + ；在负

共振谱和紫外-可见光吸收光谱对拉洛他赛分子式、 相对分子质量及化学结构进行了确证与解析，提供

离子模式下的高分辨质谱图中,拉洛他赛呈现两个

北京大学学报(医学版)• 476 •JOURNAL OF PEKING UNIVERSITY! HEALTH SCIENCES) Vol. 51 No. 3 Jun. 2019强信号峰,分别为rn/z 876- 345 4和m/z 830- 339 0,

对应[M+2Na-H] -和[M-H] -。两种模式下的

减少网状内皮系统快速清除与代谢，从而增加拉洛 他赛脂质体在肿瘤组织中的富集和滞留，有利于提 高药效并降低全身副作用(14 一16)。综上所述，本研究对拉洛他赛进行了详细的高 分辨质谱、红外吸收光谱、核磁共振谱和紫外-可见

质谱结果,验证了拉洛他赛的分子式为C45H53NO14,

相对分子质量为831.900 1。光谱测定，进行了波谱解析并制定了相应的参考标

准图谱，验证并确认了拉洛他赛的分子式、相对分子 质量和结构式， 建立了拉洛他赛的高效液相-紫外色

谱含量测定方法,可用于新药拉洛他赛脂质体的质 图&拉洛他赛脂质体的透射电镜图像Figurr 8 Transmosoon eaeoiron moorooope

! TEM) image of larotaxel liposomes在拉洛他赛的红外吸收光谱中,化学结构中的

苯环、酯基、羟基、叔丁基和酰胺结构等关键官能团 均有相应吸收峰，因此进一步验证了其分子结构上

的特征吸收峰，且吸收峰强度适宜、无杂峰,可以作

为拉洛他赛的红外吸收光谱标准对照图谱，用于该 药品的定性与鉴定。拉洛他赛的核磁共振谱中的碳信号和质子信号

较全面，信号强度适当并且几乎无杂质峰信号，在二

维核磁共振谱的指导下，】H和13C信号均能得到合 理归属，因此，呈现的核磁共振碳谱和氢谱均可作为

拉洛他赛的标准核磁共振谱，用于其药品鉴定和纯

度检测。在拉洛他赛的紫外-可见光吸收光谱中,拉洛他 赛在203 nm处有最强吸收，但是在该波长处紫外测

定具有较强的溶剂干扰效应，且在其他波段无明显

吸收，故采用常用的紫外-可见分光光度法无法对拉 洛他赛进行定量测定。虽然如此，拉洛他赛在230

nm处有较强的紫外吸收，故230 nm可用作高效液

相-紫外色谱检测的波长。为此，我们进一步建立了高效液相-紫外色谱

法，旨在建立拉洛他赛的定量测定方法。经方法有

效性验证显示，该方法灵敏、高效，具有很好的线性

关系,且回收率和精密度高,具备良好的稳定性和准

确性，可用于拉洛他赛原料药和脂质体制剂中拉洛

他赛的含量测定。此外，本研究制备的拉洛他赛脂质体稍呈正电

性、形态规整、粒径适当、大小分布均一、载药包封率

高。初步观察显示，该脂质体不易发生聚沉,其脂质 体膜上用含PEG的磷脂材料修饰，预期也可以增加

给药后在血液系统中的稳定性,延长体内循环时间，

量控制。参考文献( 1 ) V aoS， MohaesM， Roihwea F， iaa.Drug-resoaniurohe-

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