不同微生物对不同矿物作用下EPS生成差异研究

一、研究目的：探讨在不同矿物与不同微生物相互作用下，微生物EPS生成种类与产生量的差异。 二、实验材料：

1、微生物：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胶质芽胞杆菌、酵母菌、黑曲霉 2、培养基：

培养基1：牛肉膏 0.5g；蛋白胨 1g；氯化钠 0.5g；琼脂 2g；蒸馏水 100mL ；pH 7.0～7.2 ；灭菌 1.05kg/cm2，30 min。（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌适用）

培养基2：葡萄糖10g；KH2PO4 0.2g；MgSO4·7H2O 0.2g；NaCl 0.2g；CaSO4·2H2O 5g；CaCO3 0.1g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，105℃灭菌30min。（胶质芽胞杆菌适用）

培养基3：葡萄糖20g；蛋白胨5g；酵母膏5g；pH7.0～7.2，105℃灭菌30min。（酵母菌适用）

培养基4：马铃薯200g；蔗糖（或葡萄糖）20g；水1000ml，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。105℃灭菌30min。

矿物：方解石、蒙脱石、长石（钠、钾）、石英；PM2.5大气颗粒物 矿物前处理：超细粉碎到2.5um以下颗粒（分级处理？）。 三、实验方案： 1、液相培养体系

250mL三角瓶中100mL液体培养基加入小于2.5um的矿物颗粒物，在30℃培养箱中静止培养。按加入颗粒物的量探讨在不同矿物浓度条件下诱导和刺激EPS生成情况。

不接矿物为对照 2、固相培养体系

加入15mL 相对应的固体培养基在培养皿中，矿物颗粒物加到固体培养基中（以灭菌后的矿物颗粒物均匀的涂布在培养基表层），然后接种细菌，30℃培养箱中培养，按不同的作用时间提取菌苔与矿物进行分析。

不接矿物为对照 四、样品分析

对作用后产物固体或液体进行分析。 1、EPS提取：

首先经过3000rpm离心15min, 然后再用100mmol/L NaCI溶液洗涤两次，之后将菌苔重新悬浮至一定体积，并转移至提取容器中，放入玻璃珠若干，在超声仪中超声 2min，随之置于摇床上150rpm水平振荡 10min，再重新超声 2min，随后溶液经过12000rpm离心15min，得到的上清液经过0.45um醋酸纤维素膜过滤，就为提取EPS溶液，然后进行化学成分分析。 2、扫描电镜生物样品的制备方法:

1）取矿物与细菌经相应培养基培养至对数期后用微孔滤膜(0.25um)过滤或经离心机离心获取。

2）表面清洁：用蒸馏水、生理盐水、缓冲液漂洗或冲洗，清除样品表面杂物。

3）固定：一般采用戊二醛、锇酸、高锰酸钾等固定液固定。通常进行双重固定，即2%戊二醛(pH6.5)固定2h-4h后，清洗10次，用1%锇酸再固定2h，再用缓冲液洗10次。

4）不同浓度的丙酮依次脱水，过程如下:40%，5min，50%，5min，60%，5min，70%， 5 min，80%，5min，90%，10min，100%，10min，100%，5min，100%，5 min。

5）置换:先用1:1的丙酮和醋酸异戊酯置换，再用100%醋酸异戊酯置换。

6）临界点干燥：经临界点干燥仪进行干燥。 7）离子溅射。

8）扫描电镜观察并拍照记录。

3、透射电镜(TEM)生物样品的制备(超薄切片法)

1）取材：离心获取细菌。

2）固定：一般采用双重固定，即戊二醛固定1h-3h后，经相应缓冲液清洗，再用1%锇酸后固定1h-2h。

3）脱水：一般过程为30%乙醇或丙酮，5min-10min，50%乙醇或丙酮，5min-10min，70%乙醇或丙酮，5min-10min，90%乙醇或丙酮，10min-15min，100%乙醇或丙酮(三次，每次各10min-15min)。

4）渗透：包括两步，(1)将样品置于100%脱水剂及等量包埋剂的混合液中(室温、5-8h或过夜);(2)将样品置于纯包埋剂中(室温、5h-8h

或过夜)。

5）包埋：经过上述的渗透之后，即可进行包埋，常规的包埋是把经渗透后的样品挑入已装有少量包埋剂的胶囊内，或特制的锥形塑料囊，或多孔橡胶模板中，将胶囊灌满包埋剂，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需的温度及时放入温箱聚合，制成包埋块。

6）超薄切片：在超薄切片机上将材料切成600Å-900Å的厚度。 7）染色：普遍采用双重染色，即先用醋酸铀染色，再用硝酸铅染色。

8）透射电镜观察并拍照记录。 4、EPS成分分析

测定EPS为液体和固体中的含量

取培养良好的菌液（总挥发性固体含量VSS 约为6 g /L）, 加入少许NaCl 后轻轻搅拌清洗三次, 随后60 ℃水浴加热1 h，18000 rpm离心20 min 剥离EPS， 经0.22um 滤膜过滤后，将滤液置于截留分子量3500 Da 的透析袋中，密闭后置于盛有蒸馏水的烧杯中4 ℃透析12 h，得到实验所用EPS，于- 18 ℃冰箱保存备用。EPS 的蛋白质测定采用考马斯亮蓝比色法，多糖用蒽酮比色法。

40mL细菌培养液首先在4℃下 12000 rpm离心 10min，0.9%NaCI溶液水洗两次。然后将收集到的菌体重悬于0.9%NaCI溶液中，在4℃下，加入浓度为2%的EDTA提取剂10mL，提取时间为3h。提取结束后，溶液在12000rpm离心15min去除残留的细胞。提取和离心的温度保持4℃是为了避免细胞溶解和破坏EPS的结构。由于EDTA会干

扰蛋白的测定，还需将用EDTA提取的EPS溶液透析24h。最后将得到的EPS溶液通过0.45um醋酸纤维素膜过滤待用。多糖浓度采用蒽酮法测定，以葡萄糖为标准物质。蛋白浓度用Lowry法来测定，以卵清蛋白为标准物。核酸的浓度采用紫外吸收法测定。

接触角测定：接触角测定所使用的测试液体为水、1-溴萘和甲酰胺。首先将一定量的微生物菌体抽滤到0.45um醋酸纤维素膜上，用双蒸水洗涤两次，然后放在1%琼脂板上保持菌体水分。测定污泥的接触角前，将膜剪一小条下来放在载玻片上，干燥 10min。然后采用静滴技术，将1uL水、1-溴萘和甲酰胺滴到膜片上，采用CCD将液滴的形状拍摄下来，最后用软件分析计算污泥的接触角。对每一个样品，每一种液体都至少测定10-15次，取平均值。

Zeta电势测定：Zeta电势使用Zeta电势测量仪测定，菌体温度保持25℃。测定前，菌体首先被重新分散在不同电解质强度的NaCI溶液中，稀释后的细菌浓度大约为干重的0.002%－0.005%，溶液pH仍旧保持在约7.0。通过Smoluchowski方程计算得到的体系电泳迁移率，可得到菌液所对应的zeta电势。实验中对每一个样品都分别测量6次，结果取平均值。

细胞干重(DCW)测定：细菌培养液首先在4℃下6500rpm离心10min，0.9%NaCI溶液水洗两次。最后将细胞冷冻干燥24h。冷冻干燥后的细胞重量除以相应发酵液体积即为细胞干重。

PHAs含量测定：将冷冻干燥所得细胞用氯仿(10mL氯仿/0.2g干细胞)破壁，60℃保温24h，过滤，滤液自然晾干，即为PHAs。提取

出的PHAs重量与相应细胞干重的比值即为PHAS在细胞中的含量，DCW减去相应PHAS重量即为残留细胞重量。

PHAs组分的测定：气相色谱法，氢火焰检测器。毛细管柱（30mx0.320mmx0.25um，HP-5，美国），以含22%（摩尔百分比）HV（hydroxyvalerate）组分的PHAs为标准品（403113，Milwaukee，美国）。将 50mgPHAs置于 5mL V型Wheaton样品瓶中，加入2mL氯仿，2mL含15%硫酸以及2g/L苯甲酸的甲醇溶液，80℃水浴4h，取出后在试管中加入1mL去离子水并剧烈振荡，待溶液分层后取下层（有机相）检测。色谱条件：氮气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。进样室220℃，检测室250℃；初温80℃，保持4min，后以10℃/min升至200℃，保持 1min。 5、固相成分分析

矿物物相及成分分析，用XRD分析作用前后物相变化与新物质的生成。XPS分析，AFM分析。 6、液体中离子含量测定

用ICP-AES分析测定溶液中主要金属离子含量，离子色谱分析主要阴离子的含量。