５ｇｇ中华肝脏病杂志２００３年１０月第１１卷第１０期Ｃｈｉｎ １Ｈ ｅｇａｔｏｌ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００３， Ｖｏ！日，Ｎ，１０・病毒性肝炎・慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞诱导特异性Ｔ淋巴细胞应答ＮＮＩ ｝门李若冰陈红松谢尧费然丛旭范春蕾王松霞魏来王宇１摘要】 目的探讨慢性乙邢肝炎患者外周血树突状细胞（ＤＣ）是否诱导特异性下细胞应答。方法（］）将研究对象分为慢性乙型肝炎患者组、急性乙型肝炎痊愈组、健康志愿者组，分离各组研究对象的外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），细胞内细胞因子染色方法检测其对细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异表位多肚乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）ｔ８ ２７的记忆性免疫应答；（２）ｔ｝ＪＭ－（ｔ乙Ｔ？肝炎患者Ｄｃ、将负载有乙型肝炎抗原表位多肤的ＤＣ诱导特异的Ｔ细胞应答。采用细胞内细胞因子染色方法检测诱导的Ｔ细胞分泌的细胞因子，乳酸脱氢酶释放法测定诱导的，细胞杀伤活性。结果（１）急性乙型肝炎患者ＰＢＭＣ对ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴ１特异表位多肤存在记忆的免疫应答，其分泌干扰素ｖ的ＣＤ＇Ｔ细胞占ＣＤ， Ｔ细胞急数的（４．３土２．５）％，分泌白细胞介素２的占Ｃ＇．细胞数的（４．８ ｚ２．２）％，分泌肿瘤坏死因子ａ占总细胞数的（（４．６一２．３）％。而慢性乙型肝炎患者和健康志愿者对其记忆应答很低，与急性乙型肝炎患者比较差异有显著胜，ｔ值为２．５０８一３．３０５．Ｐ＜０．０５，（２）用多肤共孵育过的慢性乙型肝炎患者ＤＣ多次诱导的Ｔ细胞漫性乙型肝炎患者组，加肤孵育的靶细胞比例为３０：１＿ １０：１， ３；１时，其杀伤率分别为（５７。上２０．３）％、（４９．５士２０．２）％、（２１．８＋１２９） ％，均高干对照组，表明慢性乙型肝炎患者ＤＣ可以诱导特异的１－细胞活化结论慢性乙型肝炎患者体内缺少特异记忆性Ｔ细胞；经免疫表位多肤诱导的慢性乙型肝炎患者ＤＣ可以在体外诱导效应Ｔ细胞特异性话化。从而可以杀伤特异的靶细胞，并分泌对病毒清除有重要作用的细胞因子【关链询】 树突状细胞．肝炎，乙型：免疫应答Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ Ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＬＩ Ｒｕｏ－６ｉｎｇ， ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ－ｓｏｎｇ， ＸＩＥ Ｙ ｏ， ＦＥＩ Ｒａｎ， ＣＯＮＧ Ｘｕ， ＦＡＮ Ｃｈｕｎ－ｌｅｉ， ＷＡＮＧ Ｓｏｎｇ－ｘｉａ． ＷＦ，ＩＬｎｉ， ＷＡＮＧ Ｉｔｔ． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０（１０４４， Ｃｈｉｎａ［ Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｗｈｅｔｈｅｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ） ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １．Ｔｈｅ ｓｏ句ｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｇｒｏｕｐ（ＣＨＢ）， ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｇｒｏｕｐ （ＡＨＢ）， ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｏｒ ｇｒｏｕｐ （ＮＤ）． Ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ （ＰＢＭＣｓ） ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｏｓｅ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ， ａｎｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｅｋｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ （ＩＣＣＳ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＩＦＮ－ Ｖ ， ＩＬ－２ ａｎｄ ＴＮＦ－ ａ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＤ，＇ Ｔ ｃｅ１Ｌ ２． ＤＣｓｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ＰＢＭＣｓ ｗｅｒｅ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ， ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｕｌｏｇｏｕｓｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ １０ ｄａｙｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＩＣＣＳ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ １Ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＰＢＭＣｓ ｆｒｏｍ ＡＨＢ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｆｒｏｍＣＨＢ ｏｒ ＮＤ ｇｒｏｕｐ （ｒ ＝ ２．５０８－３．３０５， Ｐ ＜ ０．０５）． ２． Ａｆｔｅｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ， ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ （５７．０土２３．０）９， （４９．５士２０．２）％， （２１．８＋１２９）％ ａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ３０：１， １０：１， ３：１， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＢＶ ａｎｔｉｇｅｎ ｌａｃｋｓ ｉｎ ＣＨＢ ｐａｔｉｅｎｔｓ． ＤＣｓ ｆｒｏｍ ＣＨＢ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈＨＢｃＡｇ １８－２７ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ＨＢＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｋｉｌｌ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ； Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ； Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ基金项目９７３项目（编号Ｇ１９９９０５４１０６），国家自然科学基金（编号３０１７１１０４７）、北京一四八下程项目〔编号９５４０２５４００）作者单位１０００４４北京大学人民医院肝病研究所 李若冰女，３２岁，主治医师，发表论文５篇ａｌ－ ２００３， ＶｏＩ １１， Ｎ．．１０中华肝脏病杂志２００３年１０月第１１卷第１０期Ｃｈｉｎ］Ｉｌｅｐａｔｏｌ，Ｏｃｔ树突状细胞（ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ， ＤＣ）是体内分布广泛的抗原呈递细胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ， ＡＹＣ），可活化初始型Ｔ细胞，诱导初级免疫反应１１。将ＤＣ用抗原从或蛋白抗原刺激后回输，在体内可诱导特异的抗体及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ， ＣＴＬ）司。ＲＰＭＩ １６４０购自美国Ｇｉｂｅｓ）公司，胎牛血清购｝＇Ｉ美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。鼠抗人ＨＬＡ－Ａ＊０２单克隆抗体（ＢＢ７．２细胞株）由北京大学医学部陈慰峰教授惠赠，Ｔｚ细胞由第四军医大学隋延仿教授惠赠。ＦＩＴＣ结合鼠抗人ＣＤ８单克隆抗体、ＰＥ标记鼠抗人Ｖ干扰素反应，而且将其作为疫苗应用于治疗如黑色素瘤等肿瘤中已取得较好的效果［ｌ－１。实验采用体外扩增慢性乙型肝炎患者外周血ＤＣ，将其用乙型肝炎病毒核心抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ｖｉｒｕｓ， ＨＢｃＡｇ）的ＣＴＬ抗原表位多肤刺激后，通过细胞内细胞因子染色方法和乳酸脱氢酶（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＬＤＨ）释放法检测ＤＣ能否诱导特异的Ｔ细胞应答。材料与方法 １．病例选择：慢性乙型肝炎（ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ， ＣＩＩＢ）患者组（（ＣＨＢ组）７例，男４例，女３例，年龄２３一４９岁，平均（３５士１３．６）岁，纳入标准：人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＬＡ）一Ａ ＊０２阳性，丙氨酸氨基转移酶（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅ， ＡＬＴ）＞８０ Ｕ／Ｌ，乙型肝炎表面抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＢｓＡｇ）、乙型肝炎ｅ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｅａ ｎｔｉｇｅｎ， ＨＢｅＡｇ）、抗一Ｉ－ｌＢｃ均阳性（采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒为美国阿克苏公司产品），排除甲型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ，ＨＡＶ ）、丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｉｔｓ Ｃ ｖｉｒｕ， ＨＣＶ）、丁型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄ ｖｉｒｕｓ， ＨＤＶ）、戊型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ， ＨＥＶ）感染。急性乙型肝炎痊愈组（ＡＨＢ组）４例，均为北京地坛医院住院患者，男女各２例，年龄２１一４４岁，平均（３４．５ １ ８，４）岁，纳人标准：ＨＬＡ一Ａ＋０２阳性，病程Ｇ３月，发病期ＡＬＴ＞ｌ ０００ Ｕ／Ｌ，待ＡＬＴ复常后３月，ＨＢｓＡｇ阴转，抗ＨＢｓ阳转，ＨＢｅＡｇ、抗一ＩＪＢｃ均阴性，排除ＨＡＶ，ＨＣＶ， ＨＤＶ， ＩＩＥＶ感染。以上诊断均符合２０００年病毒性肝炎防治方案Ｘ３１健康志愿者组（ＩＩＤ组））６例，年龄２６一３６岁，平均（３０＋５．６）岁，纳人标准：ＨＬＡ－Ａ＊０２阳性，ＡＬＴＧ４０ Ｕ／Ｌ，乙型肝炎标志物均阴性，无其它免疫系统合并症。２主要试剂及来源：重组人粒细胞一巨噬细胞集 落刺激因子购自德国先灵葆雅公司（１．１１０ Ｕ／ｍｇ），重组人肿瘤坏死因子一。、重组人白细胞介素－４购自英国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司，淋巴细胞分离液（１．０７７ ｇ／ｍｌ ）购自北京鼎国公司。红细胞裂解液购自美国Ｓｉｇｍａ公（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ， ＩＦＮ一ｖ）单克隆抗体购自美国Ｂ． Ｄ．公司。ＰＩ？标记鼠抗人白细胞介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ， １Ｌ） －２，肿瘤坏死因子一ａ （ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ， ＴＮＦ－。）单克隆抗体、细胞内染色相关试剂如抑制细胞因子分泌试剂Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ｍｏｎｅｎｓｉｎ），破膜剂、洗液均购自美国Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司，ＣＴＬ特异性杀伤试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＦＡＣＳ固定液购自美国１３．Ｄ公司。 ３． ＨＬＡ－Ａ＊０２型别鉴定：研究对象取２００ ｐ１新鲜抗凝全血，每管１００风加人流式细胞仪检测管中，再加入２ ｍｌ红细胞裂解液反应１２ ｍｉｎ后离心，弃上清液，磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， ＰＢＳ）洗细胞两次，其中反应管加人鼠抗人ＨＬＡ－Ａ＊０２抗体（ＢＢ７．２细胞株培养上清液）１００ ｕ１， ４ Ｃ ３０ ｍｉｎ孵育后，ＰＢＳ再次洗细胞，每管加人ＰＥ标记羊抗ＦｉｂＩｇ ２川，４０Ｃ ３０ ｍｉｎ孵育后，ＰＢＳ洗涤，ＦＡＣＳ固定液２００以加人每管，４℃保存用于流式细胞仪检测。４多肤合成：依据已知的肤序列合成ＨＢＶ Ｃ区，ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限制性ＣＴＬ表位多肚ＩＩＢｃＡｇ １８－２７，序列为ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ。多肤由赛百盛公司合成，经ＨＰＬＣ纯化后，纯度为大于９０％，冻干粉末以２ ｇ／Ｌ浓度溶于二甲亚矾，－２０℃保存备用。５．外周血单个核细胞（ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏ－ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ， ＰＢＭＣ）制备：取研究对象新鲜抗凝外周血，用ＲＰＭＩ １６４０不完全培养基以１：１比例稀释，并缓慢加人淋巴细胞分离液的液面上，经密度梯度离心后取白膜层细胞，不完全培养基洗细胞两次，调整细胞浓度，１ Ｘ １０６／ｍｌ加人２４孔板，每孔加入２ ｍｌＡ工Ｍ－Ｖ无血清培养基。６． ＤＣ的培养：参照文献［４１０７．特异的记忆胜Ｔ细胞应答：用分离的ＰＢＭＣ （１Ｘ １０６／ｍｌ），加人ＨＢｃＡｇ １８－２７ ２０ ｕｇ／ｍｌ，阴性对照仅加入同体积的ＤＭＳＯ，阳性对照加植物血凝素２ ，ｕｇ／ｍｌ， ３７０Ｃ ５％ ＣＯ，孵育１ｈ后每孔均加人Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ，每毫升培养液加人０．７ Ｎｌ Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（使其终浓度为０．２ ｕｍｏｌ／Ｌ），继续培养５ｈ，培养结束，收集细胞。然后进行细胞内细胞因子的染色实验。８． ＩＩＢＶ特异的Ｔ细胞免疫应答的诱导及检测：中华肝脏病杂志２００３年１０月第日卷第１０期Ｃｈｉｎ ＩＨｅｐａｔ ｏｌ， Ｏｃｔｏｌｘｒ ２００３， Ｖｏｌ １１． Ｎｏ． １０（１）ＨＢＶ特异的ＣＴＩ，的诱导：ＤＣ培养至第９Ｈ收集后，调节细胞浓度为１ ｘ １００／ｍｌ，加人ＨＢｃＡｇ １８－２７多肤终浓度为２０ ４ｔｇ／ｍ１， ３７１Ｃ ５％ Ｃ０２孵育，同时设未加多肤对照，孵育６ １１后收集细胞，用ＰＢＳ洗脱未结合的多肤，经放射线照射，剂量为３０ Ｇｙ。将培养ＤＣ时未贴壁的淋巴细胞复苏，２ ｘ １１１淋巴细胞／子叶寿于６孔板，然后将多肚刺激并照射Ｆ的ＤＣ加人１、１０５／孔，ＩＬ－２ ５０ Ｕ／ｍ１， ３７０Ｃ ５％ Ｃ０２共同孵育１０ｄ，每隔５ｄ加人多肤刺激的ＤＣ １ｘ１０５／孔，每隔３ｄ半量换液，同时加人ＩＬ－２ ５０ Ｕ／ｍｌｏ １０ ｄ后，诱导结束，部分培养孔中再次加人多肤刺激照射过的ＤＣ １、１０５／孔，１ｈ后加Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ （０．７ ｐｌ／ｍ１），培养５ｈ后收集细胞，以备细胞内细胞因子检测ＩＦＮ－ ｙ、工Ｌ ２， ＴＮＦ－ ａ，收集剩余培养孔中细胞用｝＝ ＬＤＨ释放实验，（２）流式细胞仪检测细胞内细胞因子染色：参照文献［５， ６］ａ（３）靶细胞的制备：培养的Ｔ２细胞中加人ＨＢｃＡｇ １８－２７多肤终浓度为２０ｕｇ／ｍｌ， ３７０Ｃ ５％ Ｃ０２孵育，同时设未加多肤对照，孵育４ｈ后收集细胞，用ＰＢＳ洗脱未结合的多肚，调整细胞浓度２ｘ１０５细胞／ｍｌ。 （４）ＣＴＬ特异性杀伤实验：按ＬＤＨ释放实验试剂盒说明，效应细胞和靶细胞比例梯度设为３０：１， １０：１， ３：１，混合培养于９６孔Ｕ底板中（每个条件设３个复孔），同时设对照，３７０Ｃ ５％ Ｃ０２共同孵育５ ｈ，培养结束后，９６孔板离心２５０ ｇ， ４ ｍｉｎ，将５０以上清液转入酶标板中，按说明书操作，酶标仪检测波长４９０ ｒｉｍ的Ａ值（代表ＬＤＨ酶活性），根据公式计算相应效靶比下效应细胞杀伤靶细胞的能力。杀伤率（％）一（实验孔Ａ值一效应细胞自发释放Ａ值一靶细胞自发释放Ａ值）／（靶细胞最大释放Ａ值一靶细胞自发释放Ａ值）ｘ １００，９．统计学方法：采用样本均数ｔ检验。 结 果 １．特异记忆性Ｔ细胞应答：ＡＨＢ组患者对ＦＴＢｃＡｇ１８ ２７ ＣＴＬ表位多肤产生很强的记忆反应，而ＣＨＢ组及ＴＩＤ组产生的细胞因子远低于ＡＴＩＴ３组，见表１，２． ＤＣ诱导特异的ＣＴＬ应答：见表２０３． ＬＤＨ释放实验检测ＤＣ诱导的ＣＴＬ对靶细胞的杀伤作用：在ＣＨＢ组患者，经负荷多肤的ＤＣ诱导的Ｔ细胞对ｆ加肤孵育的靶细胞比例为３０：１、１０：１、３：１时，其杀伤率分别为（５７．０士２０．３）％、（４９．５土２０．２）％、（２１．８士１２．９）％；经负荷多肤的ＤＣ诱导的Ｔ细胞对于未加肤孵育的靶细胞杀伤比例为３０：１，１０：１， ３：１时，其杀伤率分别为（３０．４士１０．０）％，（２７．０土１２．７）％， （１３．７士３．２）％；未负荷多肤的ＤＣ诱导的Ｔ细胞对于加肤孵育的靶细胞杀伤比例为３０：１，１０：１， ３：１时其杀伤率分别为（２８．４士１０．０）％， （２４．０十１０．０） ０１０，（１４．５二３．０）％，经负荷多肤的ＤＣ诱导的Ｔ细胞对于加肤孵育靶细胞的杀伤均高于对照组。讨 论 ＨＢＶ感染机体后，体内的ＣＴＩ通过杀伤靶细胞和分泌细胞因子的非细胞毒机制抑制病毒复制，因此裹１不同人群Ｔ细胞对乙型肝炎核心抗原１８－２７的记忆应答（％）组别例数分泌细胞因了的细胞占ＣＤｓ’细胞的百分数肿瘤坏死因子一以了ＣＬ１Ｙ千扰素／ＣＤｓ白细胞介素一２／ＣＤｓ４．２６士２．４９急性乙型肝炎痊愈组慢性乙型肝炎组健康志愿者组ｆ值，尸值‘尸值４．８０＋２．２３０．１３二０．０５０．５９十０．２７４．５７土２．２９０．３７＋ ０．１８０．６８土０．３３０．１８士０．１４０．２８士０．１３２．８５１， ０．０１９２．９９９， ０．０１３２．７０９， ０．０２４２．５０８， ０．０３１３．２３５， ０．０１０３．３０５． ０．０１０为慢Ｎｉ乙型肝炎组与急性乙型肝炎痊愈组比较；为健康志原者组与急性乙型肝炎痊愈组比较，差异均有显著性裹２慢性乙肝患者淋巴细胞对乙型肝炎核心抗原１８－２７多肤刺激树突状细胞诱导Ｔ细胞反应组别例数分泌细胞因子的细胞占ＣＤ：十细胞的百分数（％）Ｖ干扰素／ＣＤｓ０．１９十０．１４０．５９士０．３９０．２８士０．１５白细胞介素－２／ＣＤ，０．１３土０．０５０．７４＋０．１６０．４６ １ ０．１３肿瘤坏死因子一叹／ＣＤ３７十０．１９５２１０３８川（２Ｊ川慢性乙型肝炎组慢性乙型肝炎组慢性乙型肝炎组ｔ值，尸值’ｔ值，尸值二２．４０１， ０．０３３２．２５９， ０．０４３２．３８３， ０．０３５２．１９１． ０．０４９２０．；：：６９土０．１５，０．０１７，０．０２８１为多肤刺激外周血单个核细胞组，２为经多肤刺激树突状细胞诱导Ｔ细胞组，３为未加多肤刺激树突状细胞与Ｔ细胞孵育组 为ｌ组与２组比较，‘为３组与２组比较浪撬豪２００３． Ｖｏｌ日．Ｎ０．１０中华肝脏病杂志２００３年１０月第ｉ１卷第１０期Ｃｈｉｎ ＩＨ ｃＤａｔｏｌ门ｃｔｏｂｃｒ 抗病毒Ｔ细胞免疫反应的强弱，很可能成为决定急性自限性感染或慢性感染的标志［７Ｉ。在急Ｎ撼染最终清除病毒的个体中，其对于ＨＢＶ的ＣＴＬ反应是多克隆、多特异性的，而在慢性感染的个体，对于ＨＢＶ的ＣＴＬ反应很弱、几乎测不到，机体对ＨＢＶ形成一种免疫耐受状态而成为慢性迁延不愈。当致病原侵人机体时，体内的免疫系统产生较强 的针对此抗原的免疫反应清除致病原，进人免疫反应的后期，多数效应Ｔ和Ｂ淋巴细胞逐渐凋亡，但是有部分淋巴细胞分化成为长寿命的记忆性细胞，再次遭遇抗原时，可以对抗原产生很强的次级免疫反应，通过杀伤感染的细胞和分泌细胞因子来消除致病原。根据表面标志及功能，分为ＣＤｎ｛和ＣＤＲ十记忆性Ｔ细膨８１。实验发现Ｃ Ｉ－Ｉ Ｂ患者和健康志愿者的ＰＢＭＣ对于ＨＢｃＡｇ１８ ２７ ＣＴＬ表位多肚的刺激生成低水平的细胞因子，而ＡＨＢ患者ＰＢＭＣ针对ＨＢｃＡｇ １８－２７ ＣＴＬ表位多肤的刺激其Ｔ细胞可分泌较高水平的细胞因子ＩＦＮ－ ｙ， ＩＬ－２， ＴＮＦ－ ａ，与ＣＨＢ患者比较差异有显著性。表明ＡＨＢ患者对ＨＢＶ有记忆性细胞存在，可以产生记忆性免疫反应，而ＣＨＢ患者对于ＨＢＶ仍处于免疫耐受状态。在免疫系统中Ｔ细胞占有极其重要的地位，Ｔ细 胞不仅有效应功能，而且是机体调节免疫功能的主体，在清除ＩｌＢＶ中，辅助性Ｔ细胞（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ， Ｔｈ）和ＣＴＬ都起着至关重要的作用，Ｔ细胞的活化需要两个信号：第一信号来自Ｔ细胞受体识别ＡＰＣ表面的主要组织相容性抗原一肤复合物；第二信号是由协同刺激分子相互作用提供的，包括ＣＤ２扩Ｂ：等，这两组信号都有ＡＰＣ参与作用，ＤＣ是其中最强的抗原呈递细胞，其表而丰富表达主要组织相容性复合物分子、协同刺激分子Ｂ：和戮附分子，分泌ＩＬ－１２，从而诱导初级免疫反应，活化初始型Ｔ细胞１９１０ ＤＣ广泛的分布于全身各器官，可以从外周摄取抗原，将其处理后呈递给Ｔ细胞，诱导免疫反应，因此ＤＣ是免疫反应的启动者。ＩＩＢＶ转基因小鼠不能对ＨＢｓＡｇ产生免疫反应，但是当将ＤＣ回输给小鼠时，可以产生正常数量针对ＨＢｓＡｇ的ＣＴＬ，Ｉ丁ＢＶ转基因小鼠刘ＨＢｓＡｇ的耐受是由于Ｔ细胞无能或Ｔ细胞忽略形成的而不是由于Ｔ细胞的缺失１１０１． ＤＣ给Ｔ细胞提积了活化必须的信号，因此产生了特异的ＣＴＬ。将ＤＣ事先以ＨＢＶ Ｃ区ＣＴＬ表位多肤刺激，再将刺激后的ＤＣ与自身淋巴细胞孵育，诱导Ｔ细胞活化，实验结果显示诱导后的Ｔ细胞均可分泌较高水平的细胞因子，与其记忆性Ｔ细胞比较分泌细胞因ｒ的水平有显著提高。不同Ｔ细胞亚群分泌的细胞因子也不同，Ｉ Ｌ －２，ＩＦＮ－ ｙ、ＴＮＦ－ ａ这３种细胞因子是Ｔｈ，型细胞因子，而且活化的ＣＴＬ也可以分泌。ＩＬ－２是Ｔ淋巴细胞主要的自分泌生长因子，同时也可刺激其它Ｔ细胞衍生细胞因子如ＩＦＮ－ ｙ的产生；ＩＦＮ－ ｙ与ＴＮＦ－。的作用相似，可以抑制病毒复制，并且可以增加工类主要组织相容性抗原分子的表达，以此促进ＣＴＬ介导的病毒感染细胞的杀伤［１９１，因此在实验中选择ｆ检测上述３种细胞因子。从实验结果显示经免疫表位多肚诱导的ＣＨＢ患者ＤＣ可以在体外诱导特异性效应Ｔ细胞活化，并分泌对病毒清除有重要作用的细胞因子。因此理论上，可以将这种经诱导的ＤＣ回输至患者体内，可以有望打破机体免疫耐受，清除体内的ＨＢＶｏ参考文献Ｉ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ， Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆｉ ｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９９， ３９２： ２４５－２５２．２ Ｎｏｕｒｉ－Ｓｈｉｒａｚｉ Ｍ， Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ７， Ｆａｙ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄｔ ｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｉｍｍｕｎｕｌ Ｌｅｔｔ， ２０００， ７４： ５－１０３中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会病毒性肝炎防止右案 ，ｉ１华用祖病杂志，２０００， ８： ３２４－３２９４李若冰，陈红松，费然，等．慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究．中华医学杂志。２００２， ８２： ８８７一８９０．５ Ｗａｌｄｒｏｐ ＳＬ， Ｐｉｔｃｈｅｒ ＣＪ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＤＭ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆａｎｔ ｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｏｒｙ／ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ＋Ｔ ｃｅｌｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｂｙ ｆｌｏｗｃｙｔ ｏｍｅｔｙｒ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ， ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃｍｅｃｈａｎｉ ｓｍ ｉｎ ＩＲＶ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ－ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９９７９９： １７３９－１７５０．６ Ｊｕｎｇ Ｔ， Ｓｃｈａｕｅｒ Ｕ， Ｈｅｕｓｓｅｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔ ｏｋｉｎｅｓ ｂｙ ｌｆｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． ７Ｉ ｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９３， １５９：１９７－２０７． ７姚祯．分子乙型肝炎病毒相关病学．北京：中国医药科技出版 杜，１９９７． １０６－１１６．８ Ａｈｍｅｄ Ｒ， Ｇｒａｙ Ｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｙｔ： ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｅｒｌａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９６， ２７２： ５４－６０９ Ｗｈｉｔｍｉｒｅ ＪＫ， Ａｈｍｅｄ Ｒ． Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ｄｉｆ－ ｆｅｒｅｎｆｌａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＣＤｓ（＋） ａｎｄ ＣＤｓ Ｔ （＋）ｃｅｌｌ ｅｒｓｐｏｎｓｅｓ． ＣｕｒｒＯｐｉ ｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０００， １２： ４４８－４５５．１０ Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ， Ｇｕｉｄｏｔｔｉ Ｌ Ｇ， Ｐｏｗｌｅｒ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｚａ－ｔ ｉｏｎ ｂｒｅａｋｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓｔ ｒａｎｓｇｅｎｅｉｃ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９８， １６１： ４５２０－ ４５２９． （收稿Ｈ期：２００２－１０－０８）（ 本文编辑：袁平戈）