s h
Chemical Constituents and Functional Study of Antrodia camphorata Product from
Solid-State Fermentation
s : ª
: § h
s h
摘要
Antrodia camphorata俗名稱為牛樟芝，為台灣特有的藥用真菌，其子實體常應用於各種疾病的治療，如，食品及藥物中毒所引起的腹瀉腹痛，高血壓，皮膚癢和抗癌。本研究的目的是探討樟芝固態培植體中具有抑制腫瘤細胞生長及具有抗氧化效果之化合物。我們分別以人類肺癌細胞(A549 cells)及直腸癌細胞(HCT-8 cells)作為篩選分析之細胞株，以搜尋粗萃取物中之有效成分。首先，以樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物作用於A549及HCT-8細胞株48小時獲得IC50分別為100μg/mL及65μg/mL。再進一步，以正向管柱層析法進行分離，由此得到6個fraction，之後將fraction 4經製備型HPLC纯化出一白色結晶物，以IR、MS及NMR進行化學結構鑑定，得此化合物分子式 : C10H12O4 ; 分子量 : 196，其結構式仍在鑑定中。
I
Abstract
The fruiting body of Antrodia camphorata is well known in Taiwan as “niu-chang chih” or “jang-jy”. The fruiting body of Antrodia camphorata has been used for the treatment of food and drug intoxication, diarrhea, abdominal pain, hypertension, skin itching and anti-tumor. The objective of this research is to identify the bioactive compounds in Antrodia camphorata’s product from solid-state fermentation with anti-tumor and anti-oxidant activities. By treating A549 cells ( a human lungs cancer cells ) and HCT-8 cells ( a human large intestine cancer cells ) with crude extracts of product of Antrodia camphorata for 48 hrs. the ethyl acetate extract was found to possess the highest anti-tumor activities with the IC50 values of 100μg/mL and 65μg/mL, respectively. The ethyl acetate extract was further separated by running through a silica gel column and six fractions were obtained. The active ingredient in F4 was purified by preparative HPLC and was structurally identified by MS, NMR and IR. The molecular formula and weight of this compound were C10H12O4 and 196, respectively.
II
謝 誌
本論文承蒙指導教授 李順來老師及許孟博老師這兩年的悉心指導教誨，並提供一切的協助及支持，才得以完成此實驗及著作，對此謹致上無限之敬意及謝意。此外，要特別感謝成功大學藥理研究所的黃嘉新先生提供諸多寶貴意見，以及在結構鑑定和細胞實驗上的協助。
此外，要感謝中興大學的蔡孟勳老師及雲林科技大學的賴世明老師遠從中部南下蒞臨指導，使本論文更加完善。還有，所上吳明利老師及化工所陳澄河老師的實驗室同學在結構鑑定上的協助。
再者，要感謝曉惠、育真學姊及鎮宇、澤彥、輝騰學長你們的教導與關懷，使我可以很快的熟悉環境，並學會許多從未接觸過的專業技術。還有，佳宏、嘉琳、育昀、威廷及班上的每一位同學，你們在學業及生活上的幫助。最後，當然少不了旭志、淑靖、芳雲、宏誠、凱珍、雅芬你們這群可愛又乖巧的學弟妹，不僅豐富了原本單調枯燥的研究生生涯也讓實驗室更充滿了活力與生氣。
最後謹將本論文呈獻給在背後默默支持我的父母、家人、朋友，還有育民，在這段忙碌的求學期間，感謝你們的體諒及鼓勵，讓我在生活上沒有後顧之憂，在此與你們分享這份成果與喜悅，並致上最深的感謝。
III
目次
摘要...................................................................................................I ABSTRACT.....................................................................................II 誌謝..................................................................................................II 目次................................................................................................IV 表目錄...........................................................................................VII 圖目錄.........................................................................................VIII 第1章 緒論.....................................................................................1
1.1 前言.............................................................................................................1 1.2 研究架構.....................................................................................................2
第2章 文獻回顧.............................................................................3
2.1 菇類三萜類之介紹.....................................................................................3 2.1.1 萜類之介紹.........................................................................................3 2.1.2 三萜類之生合成機制.........................................................................6 2.1.3 三萜類的分類.....................................................................................8 2.1.4 三萜類的生理活性...........................................................................11 2.2 樟芝之簡介與相關研究...........................................................................12 2.2.1 樟芝簡介...........................................................................................12 2.2.2 樟芝深層培養及發酵產物生理機能之研究...................................13 2.2.3 樟芝之成分分析...............................................................................17
IV
2.3 自由基與抗氧化的關係...........................................................................25 2.3.1 抗氧化劑的作用機制.......................................................................25 2.3.2 抗氧化劑之種類...............................................................................26 2.3.3 常見的抗氧化能力測定方法...........................................................27
第3章 材料與方法.......................................................................28
3.1 實驗材料...................................................................................................28 3.1.1 樟芝樣品...........................................................................................28 3.1.2 細胞株...............................................................................................28 3.1.3 設備...................................................................................................28 3.1.4 藥品...................................................................................................29 3.2 實驗方法...................................................................................................30 3.2.1 樟芝萃取液之前處理.......................................................................30 3.2.2 膠體過濾色層分析進行萃取液之初步分離純化...........................30 3.2.3 製備型HPLC進行萃取液之二次分離純化...................................31 3.2.4 HPLC分析方法..............................................................................31 3.2.5 細胞培養...........................................................................................32 3.2.6 抑制腫瘤細胞生長試驗...................................................................33 3.2.7 抗氧化能力試驗...............................................................................34
第4章 結果與討論.......................................................................35
4.1 樟芝固態培植體不同溶劑萃取物之功能性篩選...................................35 4.1.1 樟芝固態培植體乙醇萃取物之初步分離.......................................35 4.1.2 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之抑制腫瘤細胞生
長試驗...............................................................................................37 4.1.3 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之抗氧化能力測定
V
...........................................................................................................42
4.2 化合物AC-1之纯化................................................................................48 4.2.1 化合物AC-1之結構鑑定.................................................................52 4.2.2 化合物AC-1之抑制腫瘤細胞生長試驗.........................................60 4.2.3 化合物AC-1之抗氧化能力測定.....................................................62 4.3 樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經膠體過濾層析所得之其他
FRACTION之功能性測定...........................................................................64
4.3.1 各個fraction之HPLC分析.............................................................64 4.3.2 各個fraction之抑制腫瘤細胞生長試驗.........................................67 4.3.3 各個Fraction之抗氧化能力測定....................................................73
第5章 結論...................................................................................77 參考文獻.........................................................................................78
VI
表目錄
表3-1. 移動相組成....................................................................................................31 表4- 1. 樟芝菌絲體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物捕捉DPPH的能力...............43 表4-2. 樟芝菌絲體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之還原能力............................46
VII
圖目錄
圖1-1. 天然物生合成的三大路徑..............................................................................5 圖1-10. 由樟芝菌絲體中分離出五種新的MALEIC和SUCCINIC ACID....................24 圖4-1. 樟芝固態培植體不同溶劑萃取物之HPLC層析圖....................................36 圖4-2. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對A549 CELL的抑殺效果。.........39 圖4-3. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對HEP 3B CELL的抑殺效果。......40 圖4-4. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對HCT-8 CELL的抑殺效果。.......41 圖4-6. 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之還原能力。................47 圖4-7. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析分離之流程圖........49 圖4-8. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析分離所得各個
FRACTION之收集率.........................................................................................50
圖4-9. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得F4之HPLC層
析圖..................................................................................................................51 圖4-10. 化合物 AC-1以分析型HPLC在252NM下分析所得之層析圖譜。......53 圖4-11. 化合物 AC-1之TLC照片.........................................................................54 圖4-12. 化合物 AC-1之紫外線全波長(200~450NM)掃描光譜。.........................55 圖4-13. 化合物 AC-1之紅外線光譜圖...................................................................56 圖4-14. 化合物 AC-1之1H核磁共振光譜圖........................................................57 圖4-15. 化合物 AC-1之13C-DEPT核磁共振光譜圖...........................................58 圖4-16. 化合物 AC-1之EI-MS質譜圖.................................................................59 圖4-17. 化合物AC-1對人類肺癌A549細胞、人類直腸癌HCT-8細胞及人類肝
臟正常細胞 ( CHANGE LIVER CELLS) 和人類肝臟星狀細胞 (HSC CELLS)抑制生長之能力..................................................................................................61 圖4-18. 化合物AC-1捕捉DPPH的能力。...........................................................63
VIII
圖4-19. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
FRACTION以UV 252NM分析之HPLC圖譜.(A) F9 (B) F11(C) F14 (D) F15 (E)
F19...................................................................................................................66 圖4-20. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
FRACTION對
A549 CELL的抑殺效果.............................................................69
圖4-21. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
FRACTION對
HCT-8 CELL的抑殺效果...........................................................70
圖4-22. 樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物、FRACTION 11及AC-1化合物對肝臟正
常細胞(CHANG LIVER CELLS)及腫瘤細胞(A549 CELLS，HCT-8 CELLS)抑制生長能力之比較。..............................................................................................72 圖4-23. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
FRACTION捕捉
DPPH之能力。.....................................................................74
圖4-24. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
FRACTION之還原能力。.................................................................................76
IX
第1章 緒論
1.1 前言
目前已有研究顯示樟芝(Antrodia camphorata)具有保肝及抑制腫瘤細胞增生等多種生理功能，但樟芝對宿主具有專一性，僅生長於台灣特有的牛樟樹樹幹中，再加上目前仍無法以人工方式大量栽培子實體，所以實難將此一療法推廣至一般民眾。故期望能藉由深層培養的方式，快速地獲得大量的菌絲體及其發酵產物，以取代不易取得的樟芝子實體。前提是必須確認深層培養方式所得的產物，是否也同樣具有與樟芝子實體相似的效果，才具有開發的意義。
目前對於樟芝深層培養之安全性、抗氧化、保肝、增強免疫力、抗腫瘤、預防心血管疾病及降血壓等功能，已有相當的研究。研究結果證實樟芝之深層培養產物不具有毒性，同時亦具有極佳的功能性，但在抗腫瘤能力方面，所發表的文獻均未與樟芝子實體相互比較。此外，各研究亦未發現扮演抗腫瘤功能之活性成分，亦無相關機制探討。有鑑於此，本論文將從樟芝固態培養產物中區分出具有抗腫瘤活性的區分物，之後，更進一步純化鑑定具有抗腫瘤活性的活性成分。
期望本論文所得的結果，對於樟芝固態培養產物的有效成分有一評估標準，並可作為將來應用於健康食品的參考依據。
1
1.2 研究架構
A. camphorata ethanol extract (ACE) Vacuum H2O / EA partition H2O layer EA layer Functional analysis Functional analysis Column chromatography Fraction 4 p-HPLC purity Recrystallization AC-1 Fraction 9 , 11 ,14 ,15 ,19Functional analysisStructure analysis Functional analysis
2
第2章 文獻回顧
2.1 菇類三萜類之介紹
菇類，泛指真菌類形成的有性生殖器官中具有形態大至用肉眼可認明的子實體。這類的菌類多數為擔子菌(Basidiomycota)，亦包含部分子囊菌(Ascomycota)等真菌類。研究指出，擔子菌被認為是一種進化上出現較晚的菌類，因容易分解的有機物已被先住菌類佔有，所以只得以利用難以分解的有機物或與樹根結成共生關係而生存下來，因此擔子菌具有類似高等植物化合物的合成路徑，所生產的二次代謝產物有其他菌類少見的特徵，例如: mevalonic acid合成路徑所產生的三萜類及倍半萜類在擔子菌中亦為多數。(賴，1997)
2.1.1 萜類之介紹
萜類(terpene)化合物是由碳氫化合物或脂質代謝而產生，以異戊二烯為單體聚合而成的化合物，異戊二烯得自mevalonic acid合成路徑，圖1-1。萜類化合物的形成起源於生物代謝的最基本物質-葡萄糖，葡萄糖首先在酵素的作用下形成醋酸，三分子醋酸經生物合成產生甲戊二羥酸(mevalonic acid)，在具有高能鍵的三磷酸腺苷 (ATP)，經過脫羧、脫水、異構化形成 Dimethylally pyrophosphate (DMAPP)分子，化學組成通式為(C5H8)n，隨著分子中碳環數目增加，氫原子比例相對減少。
萜類普遍存在於植物界與真菌界，在動物界為數甚少。萜類的主要分類法是依據分子中包含異戊二烯單體數目分類的，含有兩個異戊二烯單體稱為單萜(monoterpene);含有三個異戊二烯單體稱倍半萜(sesquiterpenes);
3
含有四個異戊二烯單體稱為雙萜(diterpenes);含有五個異戊二烯單體稱為 二倍半萜(sesterpenes);含有六個異戊二烯單體稱為三萜(triterpenes) ;含有八個異戊二烯單體稱為四萜(tetraterpenes)等。
萜類化合物一般均難溶於水，易溶於親脂性的有機溶劑。低分子量和含官能基少的帖類，常溫下多呈液體或低熔點的固體，具有揮發性，能隨水蒸氣蒸餾，如單萜和部分倍半萜。隨分子量及官能基增加，化合物的揮發性降低，熔、沸點提高，部分多官能基的倍半萜、二萜、三萜等，多為具有高沸點的液體或結晶固體。
由於各種萜類化合物的分子中都具有相似的結構部分和共同的功能基， 所以它們在性質方面都有許多共同的表現，例如，萜類分子大多都包含雙鍵、共軛雙鍵、羰甲基、異丙烯基等，這些都有助於波譜鑒定，其所表現的共同化學反應可提供各種化學方法對萜類成分進行鑑定和提取分離。
4
圖1-1. 天然物生合成的三大路徑
1.shikimic acid pathway; 2.polyketide pathway; 3.mevalonic acid pathway.
5
2.1.2 三萜類之生合成機制
在萜類化學的研究過程中，曾一度以為異戊二烯是植物體中形成萜類化合物的單體，例如檸檬烯的蒸氣經氮氣烯釋後，均能獲得高產率的異戊二烯，反之將異戊二烯加熱至280℃ 時，兩個異戊二烯可產生Diels -Alder 反應聚合成單萜，但有研究發現，在植物的代謝過程中很難找到異戊二烯的存在，有越來越多的實驗證明，萜類化合物的形成起源於生物代謝的最基本物質-葡萄糖，經mevalonic acid合成路徑形成的 dimethylally pyrophosphate (DMAPP) 被認為是萜類成分在生物體內形成的真正前體。因此，把萜類化合物的碳架結構看成是異戊二烯聚合而成，或把萜類化合物的碳架結構分成若干個異戊二烯構成的方法，只能作為對萜類化合物的結構和分類的一種識別方法，不能代表帖類的生成途徑。
在動物或植物體裡， cholesterol 及lanosterol 在生理或生化方面均扮演著非常重要的角色，研究證實了cholesterol 及lanosterol 分別是動物和植物中經由squalene 生合成sterol 途徑之中間產物，在此生合成途徑中，配合順序不同的C-4、C-14之去甲基(demethylation)，C-24 的甲基化(methylation)、氧化還原及雙鍵等步驟，可得到不同的類三帖化合物，這些類三帖廣泛存在於生物體中，對於生物演化上佔有其關鍵的地位。由於膽固醇是細胞膜的重要組成物質，若樟芝所含之氧化型類三萜在合成膽固醇的過程中，有抑制或加速的作用，則對於癌細胞生長分裂會有很大的影響。(李，2003)
6
圖1-2. 三萜類生合成機制(李，2003)
7
2.1.3 三萜類的分類
經研究發現，由真菌產生的triterpene和steroid有許多不同體幹的三萜類，經整理分類，大約區分為幾類:(1)C27，含有Cholestane膽固醇之衍生物; (2)C28，在C-24上有甲基取代的Ergostane之固醇骨架; (3)C30，Lanostane骨架之衍生物; (4)C31，在C-24上有甲基或甲烯基取代的Lanostane之衍生物; (5)雜類的三萜，包括少數的五環三萜，以及各種在C-4，C-14位置有去甲基化的Lanostane或C-14-methyl Lanostane之類固醇; (6)Fusidane和Prostane不同骨架的三萜類; (7)Viridin及其衍生物; (8)C-24上有乙烷基或乙烯基取代之Cholestane衍生物，如Fig1-3所示。
天然界中多孔科(Polyporaceae)和相關高等真菌皆富含四環三萜，尤其是C30和C31型帶酸基之類三萜，這種三萜於高等植物很少見，例如:赤芝屬多孔菌科，擔子菌亞門，直至1988年已有103個以上的新三萜類被發現，這些化合物結構上屬於高氧化態的 Lanostane (C30型)骨架之三萜衍生物，以及側鍵氧化分解之衍生物，按其分子中所含的碳數可分為C30、C27、C24三類，再根據其所含的官能基和不同側鍵可進一步區分，Fig1-4(李,20)所示，由於大多數的三萜類都具有共軛體系，故具有吸收紫外光的特性，且強度很規律，依照共軛雙鍵的位置可分為三類，凡在C11上存在羰基的化合物都存在△ 8 ( 9 )雙鍵，這類化合物的紫外吸收λmax在252nm ，Log e在3.8~4.1 之間; C11 沒有羰基的化合物的大多存在△ 7 ( 8 )△ 9 ( 1 1 )共軛雙鍵，這類化合物紫外吸收λmax在244nm， Log e 在3.7~4.7 之間，即沒有α、β不飽和酮，又沒有共軛雙鍵的化合物的紫外吸收，只表現為簡單雙建的紫外吸收λmax在210nm，Log e在4.2 左右。
8
圖1-3. 真菌三萜類之分類. (李，2003)
9
圖1-4. Ganoderma lucidum三萜類之分類. (李，2003)
10
2.1.4 三萜類的生理活性
自從Kubota等人，於1982年首次從赤芝子實體中分離得到三萜化合物以來，截至目前為止，已經先後從赤芝子實體及孢子中分離鑑定出一百多種三萜類化學成分。三萜化合物是菇類的苦味來源，主要見於各種靈芝、猴頭菇及台灣特有的樟芝。報告指出，從靈芝分離得到的三萜類中靈芝酸 ganoderic acid R、T-Z在體外試驗具有抑制肝癌細胞增殖作用，又 ganoderic acid A、B、C1、C2 具有抑制大鼠肥胖細胞游離組織胺(histamine)的作用，ganoderic acid B、C2 有抑制血管緊張素(antitensin)轉化酵素的活性。(賴，1997)
11
2.2 樟芝之簡介與相關研究
2.2.1 樟芝簡介
「樟芝」原為台灣原住民口中的神奇仙丹，早期原住民因飲食因素，嗜飲酒，於是常引起肝臟病變，在偶然機會下，有人發現牛樟樹上長出的芝狀物，經試食，具解宿醉、解毒、治療腹痛，甚至可改善癌症及其他慢性病等功能。以下將針對樟芝之分類型態，生理功能及主要成分進行介紹。 1.分類
樟芝(Antrodia camphorata)在民間有樟菇，樟菰，樟內菰，牛樟菇或紅樟等稱呼，只寄生於台灣牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)上，為台灣特有的真菌。樟芝存在已久，直至1990年才由中國科學院昆明植物研究所臧穆教授和台北醫學院蘇慶華教授首次發表，但因當時的標本滲有靈芝孢子，因此將之歸類為靈芝屬（Gauoderma comphoratum Zang et Su. Sp. NoV.），命名為Ganoderma camphorata。直到1995年，張東柱博士依據樟芝子實體外觀、氣味、生長速率、孢子顯微結構特性，判定應為多孔菌科Antrodia屬之一種，命名為Antrodia cinnamomea (Chang and Chou，1995)。直到1997年，吳聲華等人整合前兩次文獻內容後重新發表，將樟芝命名為Antrodia comphorata。確定樟芝屬於真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、同擔子菌綱(Homobasidiomycetes)、無褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)。 2.型態
樟芝子實體屬多年生，具有強烈沖鼻的樟樹香味，外型呈板狀或鐘狀，
12
一年生，無柄，新鮮者表面呈鮭紅色，老熟後顏色呈桔色或黃色，菌蓋半 圓形，直徑10~20╳3~8公分、厚2~2.5公分，表面具不明顯的縱皺，有光澤，邊緣平而鈍，菌肉兩層，上層為木材色、下層為象牙色，乾燥後其表面呈黑色或黑褐色 (高，1991)。單孢子卵圓形，有雙層，外壁透明、內壁呈金黃色，具分離或連接之棘形突起，孢徑14~19╳7.8~14.4微米，菌孔微細綿密，每毫米有4~5個，管口小，呈深紅色，子實體大小變化極大，可大至20╳30公分，重達5公斤以上，或小至一層薄片，但生長緩慢。(臧和蘇，1990)
樟芝只寄生在野生牛樟樹洞中，是牛樟樹上目前唯一發現的木材腐杉菌，病徵為褐色腐杉，故為褐腐菌。牛樟樹為台灣特有的常綠闊葉大喬木，生長於海拔200~2000公尺的山區。今日台灣的牛樟樹在大量砍伐及無造林工程的雙重打擊下，已難得一見，所以被列為一級的國寶級保護樹種，相對地，也提升了樟芝價值。(陳，2001)
2.2.2 樟芝深層培養及發酵產物生理機能之研究
1.深層培養介紹
目前樟芝仍無法以人工方式栽培，但已可利用固態及液態培養的方式工業化生產樟芝菌絲體。深層培養(submerged culture)，一般是指使用固定組成之液態培養基，在控制適當的pH值、溫度以及通氣和攪拌(或震盪)的條件下，進行微生物的發酵培養，以製造生質量(biomass)或其他代謝物(metabolites)。菇類深層培養最大的特色在於發酵過程中並無子實體的產生，所產生的菌絲體以圓球狀形式存在。固態發酵則是使用固態物質當作基質，讓菌絲體生長在上面。與液態深層發酵相比，使用固態發酵培養，微生物能產生較大量的胞外酵素，或其他二次代謝產物。另有研究指出，
13
色素與香味也必須藉由固態培養來生產。
樟芝深層培養方式是將樟芝菌絲體培養在含葡萄糖2%、酵母抽出物0.5%、蛋白凍0.5%、硫酸銨0.3%、硫酸鎂0.3%、磷酸二氫鉀0.3%、檸檬酸0.05%及pH4.5的培養基中，接入菌種量為0.1%，攪拌速度90rpm，通氣量0.5vvm，培養溫度28℃，在50噸不鏽鋼槽體進行35噸液態培養，8天後可得到紅色菌絲，收率可達1.8%，多醣體含量在8%以上，多醣體的含量隨菌絲量增加而升高。(王，2002)
李(2003)發現利用小薏仁為固態培養基質，添加微量牛樟樹木屑，起始含水量控制在56.0%，於25℃下培養14天，可有效的增加樟芝中三萜類的種類與含量。
利用深層及固態培養的方式生產樟芝菌絲體具有調控標的產物含量、降低成本及大量生產的優點，但都必須先經由研究確認發酵所得的菌絲體是否具有毒性，和野生採集的樟芝是否具有相似的生理功能，這樣才能克服樟芝生長緩慢的缺點，以提供大眾平價、安全且有效的樟芝製品。 2.安全與藥理研究
陳等人(2001)將樟芝菌絲體以Salmonella typhimurium進行致突變性試驗，發現在0.1~10 mg/ml範圍內，均無致突變性。以中國地鼠肺細胞株(CHL)檢驗是否會誘導染色體變異，結果為陰性反應。在致畸胎試驗，在SD雌鼠懷孕期間餵食樟芝發酵液乾燥品500 mg/kg/day，發現對於雌鼠的子宮重量、生育指數、授精卵著床前流失率、著床後死亡率及胎鼠平均重量均與控制组無顯著差異，由胎鼠之外觀、內臟及骨骼檢查結果顯示，樟芝發酵液無致畸胎毒性。郭(2002)連續經口投予樟芝發酵液28天，發現其安全劑量在2 g/kg以下，對血液及尿液生化學的指標均在安全的範圍內。在急性
14
毒性試驗，發現樟芝發酵液的大鼠一半致死劑量大於15 g/kg，顯示急性毒 性很低。江等人(2002)以每日餵食3 g/kg樟芝發酵液予小鼠連續15天，對小鼠並不具致基因毒性，且對化學致癌物dacarbazine所誘發的DNA損傷有明顯的抗拮作用，故有抗基因毒性的功能。 3.抗氧化功能
在活體外系統中，樟芝子實體及菌絲體萃取物均具有清除自由基及螯合金屬離子的能力，而且其抗氧化能力不亞於維生素E及抗氧化劑BHA (butylated hydroxyanisole)( Huang et al., 1999)。也有研究發現，樟芝菌絲體甲醇萃取物的總多酚類含量與抗氧化能力呈正相關，其中更在這萃取液中檢驗出ascorbic acid 及tocopherol的存在(宋, 2001，Mau et al., 2004)。Hseu等人(2002)研究顯示樟芝菌絲體水萃物可減少紅血球溶血的現象，此外發現具有毒殺淋巴癌細胞(HL-60 cell)的能力，但對正常內皮細胞卻不具細胞毒性，由此推論樟芝菌絲體可能具有保護性的抗氧化作用以及抗腫瘤能力。蔡(2002)發現樟芝深層培養液之多醣體可藉由提昇GST酵素活性之能力，來提昇H2O2之代謝能力，因此可抑制脂質過氧化作用，並且維持GSH/GSSG ratio在還原狀態下，減少DNA damage以及細胞毒性，由此保護DNA避免氧化傷害。 4.保肝功能
郭(2002)研究顯示，以樟芝發酵液(1g/kg)餵食經四氯化碳誘發慢性肝炎的老鼠，具有改善的效果。另外，樟芝發酵液(2 g/kg)也能抑制dimethylnitrosamine所引起的肝臟纖維化。也有研究證實，樟芝子實體與菌絲體均有降低酒精所誘發之急性肝損傷的功能，而其保護機制應與其所具有的抗氧化與清除自由基能力有關。陳(2002)之研究發現，在3，12.4，24.8ml/kg b.w/day之劑量下，於四氯化碳投予前一周，每天連續八週餵食
15
樟芝發酵液，直到實驗終了，結果顯示樟芝發酵液對四氯化碳誘發的慢性 肝損傷有保護的能力，其保護機制應與其提升抗氧化與解毒酵素(glutathione peroxidase , glutathione reductase 及glutathione S-transferase)活性與抑制肝臟與血漿脂質過氧化能力有關。Lee(2002)檢測不同品種的樟芝，發現所有的樟芝菌絲多醣體均有抗B型肝炎病毒的活性，其中B86在50 µg/ml有強烈抑制B型肝炎病毒表面抗原的作用，而且比1000單位/ml α-干擾素效果更佳，而且所有樟芝菌絲多醣體均無細胞毒性。 5.增強免疫力及抗腫瘤功能
呂(2002)研究結果顯示，在體外(in vitro)實驗中，樟芝多醣萃取液(AC-PS)對人類血液單核細胞有明顯之活化作用。經由AC-PS(100μg/ml)刺激而製備之單核細胞培養液具有明顯的抑制U937 白血病細胞增生之作用，其抑瘤率高達55-60 %，此外，尚可誘導U937白血病細胞分化為成熟的單核球~巨噬細胞，並具有吞噬活力及產生超氧化物之功能。在體內(in vivo)實驗中，小鼠在給予樟芝菌絲多醣1個月後，脾臟細胞之增生能力及非特異性自然殺手細胞活性有顯著的增加。此外，對植有Sarcoma 180的ICR小鼠，無論是經由腹腔亦或是經餵食樟芝菌絲多醣後，其腫瘤抑制作用具有Dose-dependent 現象。
沈(2004)以樟芝菌絲體萃取液處理Hep G2 及Hep 3B 肝癌細胞時，IC50
分別為24.6 及48.1µg/ml。在細胞形態方面，發現以牛樟芝菌絲體萃取液處理之肝癌細胞皆有皺縮情況發生，且增加細胞懸浮現象。在細胞週期的影響方面，以50 µg/ml萃取液處理的肝癌細胞，則使Hep G2 被滯留於G2/M 期，而Hep 3B被滯留於S期。
16
6.其他功能
樟芝的甲醇萃取物可以抑制金黃色葡萄球菌及鬚瘡小芽癬菌的生長，而且具有腸道弛緩運動及血小板凝集作用(簡等, 1997)。在降血糖方面，嚴(2002)的研究顯示，樟芝發酵液或菌絲體具有降低血糖之效果，且發酵液有降低血脂異常的趨勢與改善肝臟之氧化壓力，故對於改善糖尿病具有正面的保健效果。在降血脂方面，劉(2002)發現樟芝菌絲體和發酵液對於脂質代謝與抗氧化能力皆具有正面保護功能。另外，葉(2002)也提到，樟芝可以保護血管內皮細胞降低自由基誘發的氧化傷害及抑制氧化型LDL的形成，進而降低動脈硬化的發生。
2.2.3 樟芝之成分分析
樟芝之一般成分
樟芝子實體中含固形乾物31%，其中碳水化合物及纖維素的含量佔總重的58%，蛋白質約佔7%，粗脂肪(包含游離脂肪酸、單(雙、三)酸甘油脂、固醇類及磷脂質等)含量佔35%，遠高於其他菇類的脂質含量，由此可說明樟芝具有較高量精油的原因。(黃，2000)
在乾燥的樟芝菌絲體中，固形乾物佔93%，其中以碳水化合物的含量最為豐富(57%)，其中包含不溶性纖維(7%)及可溶性糖(25%)，可溶性糖以還原糖(包含阿拉伯糖醇(arabitol) 、海藻糖(trehalose)和葡萄糖(glucose))為主，其他還包括灰分(4%)、脂質(10%)及蛋白質(10%)等成分，其中灰分的含量較子實體高，此可能與培養時添加的無機鹽類有關 (Chang et al.,2001)。在維生素分析上則發現菌絲體之維生素B6及Niacin 含量明顯高於子實體，尤其是Niacin更高達130倍，維生素B12 則略低於子實體，在色素方面，樟芝呈現鮮豔的鮭紅色，於實驗時發現甲醇萃取出之橘紅色物
17
質，在中性pH 下橘紅色會轉為褐色，若再滴定至酸性時會再回復為橘紅 色(邵，2004)，但並未發現β-carotene 存在。在樟芝的菌絲體中曾鑑定出核苷酸含5’-CMP, 5’-GMP, 5’-UMP, 5’-IMP, 5’-XMP 等呈味物質(Chang et al.，2001)。 樟芝之有效成分 1.樟芝之多醣
黃鈴娟(2000)指出，在樟芝發酵液中萃取出14.3%的多醣體，組成以葡萄糖、木糖和甘露糖為主，其分子量介在1.1萬Da左右;水萃物及鹼萃物中所含之多醣體其分子量則介在76萬Da上下，兩者中皆含有葡萄糖、木糖、半乳糖和醛糖酸等單糖，屬雜多糖。經光譜分析後皆為含有具生理功能的β-D-葡聚糖(β-D-glucans)。Cheng(2005)首次在樟芝液態發酵菌絲體中發現脂多醣(lipopolysaccharide)的存在，並證實從中萃取所得的LPS在醣基組成上有別於細菌的LPS，對細胞的毒性遠低於細菌的LPS，而且對於ICAM-1的表現具有負調控的作用及可抑制monocyte-endothelial間的黏附作用，由此可說明樟芝LPS具有抗發炎之生理活性。 2.樟芝之三萜類
樟芝三萜的研究大都集中在子實體三萜類的化學成分分析和結構式的建立，Cherng 等人(1994)從樟芝子實體之甲醇萃取液中發現sesqiterpene lactone，phenyl和diphenyl等化合物；Cherng等人(1995)再從樟芝子實體之甲醇萃取液中發現三種新的化合物，以ergostone為骨架的三萜類化合物，antcin A，antcin B，antcin C 及兩種以lanostane為骨架的三萜類化合物。Cherng(1996)以同樣的分析方法再發現四種新的以ergostone為骨架的三帖類化合物antcin E，antcin F和methyl antcinates G，methyl antcinates H；同
18
年，Yang等人(1996)也從樟芝子實體中發現兩種以ergostone為骨架的三帖 類化合物zhamkuic acid D，zhamkuic acid E和三種以lanostane為骨架的三帖類化合物。
在論文方面，有楊書威(1990) 、高曉薇(1991) 、程一華(1994)和吳德鵬(1995)等人，其研究主軸仍為樟芝子實體中的三帖類的化學成分分析和結構式的建立。楊書威(1990)從樟芝子實體發現3 種以ergostane 為骨架的新化合物zhankuic acid A(1)、B(3)、C(4) ， 從菌絲體發現5 種三萜化合物:zhankuic acid D(2) 、zhankuic acid E(5)、15a - acetyl-dehydro -sulphurenic acid(6)、dehydroeburicoic acid(7)、dehydrosulphurenic acid(8)，結構如圖1-5，其中主要的zhankuic acid A、C對P388淋巴癌細胞株有細胞毒殺作用，而zhankuic acid A、B具有anticholinergic及 antiserotonergic的活性(Chen and Yang,1995)，其他成分則因含量較少而沒有進行藥理測試。
高曉薇(1991)是以丙酮於室溫萃取樟芝粉末，得到的萃取物以少量甲醇溶解後濾去沉澱，取沉澱(中極性部分)進行分離，得到六種固體，只解出三個結構為新化合物，結構如圖1-6。在藥理試驗上，證實化合物B具有降低以四氯化碳誘發急性肝障礙小白鼠之血中GPT 值之作用。
程一華(1994)將樟芝子實體以甲醇加熱回流萃取，過濾、沉澱、分離得十個三帖類，一個聯苯化合物，以及二個不飽合脂肪酸(圖1-7.)。程發現樟芝甲醇萃取量達30%，比一般靈芝3%的萃取量高，而且嚐起來的苦味又比靈芝強烈，猜測應為其中含有高量的多氧化型三萜及固醇類造成的。
吳德鵬(1995)將樟芝子實體粉碎後，以甲醇加熱迴流萃取，經矽膠管柱色層分析，高效能液相層析等方法，得到十二種成分，其結構如圖1-8，其中化合物【3】∼【5】是為發表於文獻上的新類三萜化合物。
19
周(2002)將樟芝子實體先以酒精萃取，再以水與二氯甲烷進行液液萃 取，取其有機層進行分離，得14種成分，其結構如圖1-9，其中四種成分3β, 15α –dihydroxylanosta -7,9(11),24-trien-21-oic-acid【7】，sulphurenic acid【9】，versisponic acid D【11】及actcin K【13】係首次從樟芝獲得，而成分【7】和【13】更是首次由天然物界發現。
20
圖1-5. 由樟芝子實體中分離出九種三萜類 (楊，1990)
圖1-6. 由樟芝子實體分離得到的三種成分 (高，1991)
21
圖1-7. 由樟芝分離得到的十三個成分(＊ 表示新化合物) (程，1994)
圖1-8. 由樟芝子實體分離得到的三萜化合物 (吳，1995)
22
圖1-9. 由樟芝子實體分離得到的十四個成分 (周，2002)
23
3.其他有效成分
宋祖瑩(2003)將樟芝菌絲體中經甲醇萃取，再以製備型HPLC純化，得到一化合物3-Methyl-butyric acid 4-(3-methyl-but-2-enyloxy)-phenyl ester，該化合物對於人類肝癌細胞Hep G2和Hep 3B具有細胞毒性，IC50分別為49.5及62.7μg/ml。
Norio Nakamura(2004)在樟芝菌絲體中分離出五種新的maleic和succinic acid ，結構如圖1-10.，且這些新的化合物對於LLC腫瘤細胞均具有細胞毒性，其中以化合物2，3的效果較佳，EC50分別為3.6及7.5μg/ml。
圖1-10. 由樟芝菌絲體中分離出五種新的maleic和succinic acid. (Norio Nakamura，2004)
24
2.3 自由基與抗氧化的關係
2.3.1 抗氧化劑的作用機制
抗氧化劑對油脂的酸敗作用機制包括抗氧化劑本身釋放出氫原子與自由基反應，而終止自由基連鎖反應的進行，或是與氧分子作用，或螯合金屬離子以減緩脂質氧化的速率，因此，天然抗氧化物質若能具有上述之特性，則對其抗氧化活性必有所增進。
Dzieak(121)將抗氧化劑的作用機制分成三類，第一類為自由基抑制劑(free radical inhibitor)，因此類型的抗氧化劑提供了主要的抗氧化效果，故又稱一級抗氧化劑(primary antioxidants)。此型抗氧化劑大部分是屬於酚類化合物(phenolic compounds)，它會釋放出氫氧基上的氫原子，而提供一個電子或是直接提供一個氫原子與脂質氧化生成之自由基作用，使之轉變成較穩定型式之產物如氫過氧化物，以終止氧化反應的進行。此種自由基抑制劑以BHA、BHT 及TBHQ 為此類型合成抗氧化劑之代表。
第二類抗氧化劑為氧捕捉劑或還原劑(oxygen scavengers or reducing agent)。此類型的抗氧化劑之作用機制在於捕捉氧分子或是還原已氧化之過氧化物。由氧分子活化所形成之活性氧(active oxygen)，如超氧陰離子(O2-)及氫氧自由基(•OH) 等激發態的氧分子，或是非自由基類的過氧化氫(H2O2) 都具起始及加速脂質氧化反應進行的能力。其中氫氧自由基是最富反應性的自由基，由於它本身是一種很不安定的氧化劑，因此對脂質氧化有極強的促進作用，在生理上也造成oxygen toxicity，導致細胞發生突變和癌化的現象。超氧陰離子和過氧化氫的反應性雖不如氫氧自由基強，但是此二者卻都產生氫氧自由基。因此活性氧的捕捉對於脂質氧化及生理的影響都有
25
莫大的助益。此類抗氧化劑以抗壞血酸(ascorbic acid ) 為典型代表。其可以 還原失去氫原子之酚類自由基，而本身被氧化成dehydroascorbic acid，因而達到增強抗氧化能力之目的，此外，如氧化態的生育醇亦可藉由抗壞血酸的添加而再還原成生育醇。
第三類抗氧化劑為金屬螯合劑(metal chelator)。在油脂或含油脂的食品中大都含有或多或少的金屬離子，而即使其含量低至0.1 ppm 即有促進脂質氧化速率的能力。在多種金屬離子中以鐵及銅離子對於促進脂質氧化作用的進行最具效果。因此抗氧化劑若具有螯合金屬的能力，則能達到延緩脂質氧化進行的目的。此類型抗氧化劑如檸檬酸、磷酸及EDTA (ethylene diamine tetracetic acid) 。
2.3.2 抗氧化劑之種類
目前一般常使用之人工合成抗氧化劑有丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole, BHA）、二丁基羥基甲苯( butylated hydroxy toluene, BHT ）、棓酸丙酯（propyl gallate, PG）及第三丁基對氫羥（tertiary butyl hydroquinone, TBHQ ） 四種。由於此類之抗氧化劑價格便宜且效果佳，因此被廣用於食品添加中。但近年來許多研究指出，添加於食品之人工合成抗氧化劑對人體造成不良之影響，如：導致肝臟的病變及致癌性等等。因此尋找出天然之抗氧化劑為重要課題之一。一般而言，天然之抗氧化劑可從植物、動物及微生物三大類去取得。而目前已知較具抗氧化性之天然抗氧化成分，有下列幾類：類黃酮(flavonoids）、維生素(vitamins）、類胡蘿蔔素(carotenoids）、抗壞血酸(ascorbic acid）、苯酚化合物(phenolic derivatives）、多醣類化合物(polysaccharides）、胺基酸(amino acid）及微量元素(minerals）等。近來也發現食藥用菇具有自由基清除能力；並有研
26
究提出食藥用菇可為提供抗氧化物之來源， 因此食藥用菇之抗氧化性質值 得加以探討。
2.3.3 常見的抗氧化能力測定方法
(1)清除α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)自由基能力之測定 原理:
油脂在氧化過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見的抗氧化物藉由提供氫(hydrogen doner)來清除脂質過氧化自由基(peroxyl radical)進而達到抑制氧化連鎖反應之進行，在抗氧化的研究上通常使用DPPH來評估抗氧化的供氫能力。DPPH之甲醇或乙醇溶液在517nm下有強吸光，但是被抗氧化劑(AH)還原時則吸光值降低，因此在517nm 的吸光值越低即表示抗氧化劑的供氫能力越強。
(2)還原能力測定 原理:
，藉還原力以測定普魯士藍 (prussian blue, Fe4[Fe(CN)6]3)生成量為指標由赤血鹽(prussian ferricyanide, K3Fe(CN)6 )還原成黃血鹽( K4Fe(CN)6 )後，再與三價鐵離子作用生成普魯士藍，並以分光光度計在最大吸收波長700nm下測定普魯士藍含量，用以檢測樣品的還原力。樣品若將鐵離子還原成亞鐵離子，再與三價鐵生成普魯士藍而使吸光值上升，則表示樣品的還原力愈強。
27
第3章 材料與方法
3.1 實驗材料
3.1.1 樟芝樣品
由南台科技大學生物技術研究所 李順來老師提供樟芝固態培植體乙醇萃取液。
3.1.2 細胞株
人類肝癌細胞( Hep 3B cell ) 、人類肺癌細胞（A549 cell）、
人類直腸癌細胞（HCT-8 cell）、人類肝臟正常細胞 ( Chang liver cell) 。
3.1.3 設備
儀器
真空減壓濃縮機 真空減壓乾燥箱 真空冷凍乾燥機 分析型HPLC幫浦 分析型HPLC偵測器 分析型HPLC自動注射器 分析型HPLC管柱
Silica 60 F254 TLC板 20*20cm 倒立電子顯微鏡 CO2恆溫培養箱 細胞培養瓶 (tissue culture flask)
28
廠商，型號
Heidolph , LABOROTA4000 DENG YNG
KINGMECH , FD-4.5-12P Hitachi , L-7100 Hitachi , L-7420 Hitachi , L-7200 Thermo , C18 column MERCK Nikon , TE2000-U NUAIRE FALCON
TM細胞培養盤 (microtest 96)
FALCON MARIENFELD
血球計數器
3.1.4 藥品
試藥
Methyl alcohol
Ethanol absolute anhydrous Alcohol 95% Ethyl acetate Acetonitrile acetic acid
廠牌 Mallinckrodt J.T.Baker
台灣公賣局 J.T.Baker Mallinckrodt Fluka
備註 LC級 分析級 食品級 分析級 LC級 分析級
分析級 n-Hexanes Lichrosolv 分析級 Chloroform Mallinckrodt DMEM
(Dulbecoo,s Modified Eagle,s Medium)
FBS (Fetal bovine serum) L-glutamine 200mM
GIBCO
細胞用
GIBCO GIBCO
Penicillin-streptomycin GIBCO Trypsin-EDTA GIBCO Trypan blue solution (0.4%)
SIGMA
29
3.2 實驗方法
3.2.1 樟芝萃取液之前處理
將樟芝固態培植體乙醇萃取液以減壓濃縮至乾，再分別以水(H2O)與乙酸乙酯(EA)進行多次分配萃取，直至乙酸乙酯層呈澄清狀。
3.2.2 正向管柱層析法進行萃取液之初步分離純化
取樟芝乙酸乙酯萃取物吸附於矽膠(silica gel 60)上，再充填至矽膠管柱上:選用管柱規格為30cm，id 3cm的管柱，使用矽膠與沖提液1(表3-1)進行充填，輕敲使之緊密，充填管柱達20cm即可，保留三公分液面，再以乾填的方式填入已吸附於矽膠上之樟芝乙酸乙酯萃取物，即完成管柱填充。進行管柱色層分析，依序加入三倍填充管柱體積(約400 mL )之移動相，以不同比例之正己烷(Hexane)/氯仿(Chloroform)/甲醇(Methyl alcohol)為移動相沖提液進行梯度分離(表3-1)。每100 ml沖提液收集為一瓶，濃縮至乾並秤重。將上述之收集液以乙醇回溶再利用HPLC分析，加以檢視，合併成分相似的樣品。
30
表3-1. 移動相組成
n-Hexane Chloroform移動相1 移動相2 移動相3 移動相4 移動相5 移動相6
MeOH
9 1 - 1 9 - - 10 - - 30 1 - 14 1 - 7 1
3.2.3 製備型HPLC進行萃取液之二次分離純化
合併經膠體過濾層析分離的fraction 4~6的沖提液，以0.22μm filter過濾，再以製備型HPLC進行分離純化。HPLC分析條件如下:
分析管柱 : Thermo C18 column (60×300 mm ,5μm) 流速 : 10.0 ml/min 偵測器 : UV-252 nm 移動相 : 42% acetonitrile
3.2.4 HPLC分析方法
將初步分離的不同溶劑樟芝萃取液以0.22μm filter過濾，再以HPLC進行分析。HPLC分析條件如下:
31
分析管柱: Thermo C18 column (4.6×250 mm ,5μm) 流速:1.0 ml/min 偵測器:UV-252 nm 移動相: (A) acetonitrile
(B) 2 % acetic acid solution
(C) 33 % acetonitrile Time programe: Time(min)
A (%)
B (%)
C (%)
0 0 100 0 4 0 100 0 5 0 0 100 15 10 0 90 25 20 0 80 40 100 0 0 50 0 100 0 60 0 100 0
3.2.5 細胞培養
細胞以含有10 %胎牛血清(FBS)，2 mM L-glutamine及penicillin之DMEM ( Dulbecoo,s Modified Eagle,s Medium )為完全培養液，培養於5% CO2之37℃之恆溫培養箱中。每隔三天更換新鮮的培養液，待細胞長成九分滿時，移去培養液，以PBS ( phosphate buffer saline , pH 7.4, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 1.74 g K2HPO4 per liter )清洗附著於
32
flask上的細胞兩次，利用1 mL trypsin-EDTA消化細胞1~2分鐘，再以兩 倍體積的DMEM中和trypsin-EDTA反應，取約0.5 mL細胞液與4.5 mL DMEM培養液混合於新的flask培養。
3.2.6 抑制腫瘤細胞生長試驗
於96 –well盤中在每孔中種入1╳105顆細胞，於5% CO2之37℃之恆溫培養箱中培養12小時，移去DMEM，再加入200μl含不同濃度之樟芝萃取物之培養液，培養48小時後，以MTS assay 套組進行腫瘤細胞存活率測試。
MTS assay (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxyphenyl]-2- [4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium,inner salt)是利用粒腺體活細胞的脫氫酵素(dehydrogenase)將MTS還原成會產生暗紅色螢光的formazan。此螢光物質在波長492 nm有最大吸收值，以此方法測定活細胞數目。
使用步驟如下:由上所述，將經過樟芝萃取物處理48小時的細胞除去舊的培養液，再於每個well中換上100μL 的DMEM及加入20μL的MTS/PMS溶液，反應1~4小時後，使用酵素分析儀(ELISA reader 3112e, Bio-TEK)於波長492 nm下測定細胞存活率(cell viability) 。
比較細胞經萃取物處理(樣品組)與未以萃取物處理(對照組)後的存活細胞比率，其計算公式如下:
細胞存活率 = (樣品組O.D值/對照組O.D值) ╳100%
33
3.2.7 抗氧化能力試驗
(1)捕捉α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)自由基能力之測定 樣品處理:
先將樣品溶解於水或甲醇中。取4 mL不同濃度的樣品加入1 mL新鮮配置的10 mM DPPH溶液中，震盪混合均勻，於室溫下靜置30分鐘，使用分光光度計檢測517 nm之吸光度。
結果判定:
Scavenging effect (%) =
[(A517nm of control - A517nm of sample)/(A517nm of control)] ╳ 100
(2)還原力測定 樣品處理:
將樟芝萃取物溶於甲醇，配製成不同的濃度。取2.5 mL樟芝萃取物之甲醇溶液，加入2.5 mL, 0.2 M, pH6.6 phosphate buffer 及2.5 mL 1%赤血鹽(potassium ferrcyanide, PFC) ，於50℃水浴20分鐘後快速冷卻，再加入2.5mL 10% trichloroacetic acid (TCA)溶液，混合後以3000 rpm離心10分鐘，取其上清液5 mL，並加入5 mL蒸餾水及1mL 0.1% ferric chloride溶液，混合均勻，於10分鐘反應後以分光光度計測定700 nm之吸光值。吸光值愈高表示還原力愈強。
34
第4章 結果與討論
4.1 樟芝固態培植體不同溶劑萃取物之功能性篩選
4.1.1 樟芝固態培植體乙醇萃取物之初步分離
取一公升樟芝固態培植體乙醇萃取液( ACE )真空乾燥後，得367.4公克的乙醇萃取物，經液相分配萃取初步區分為水層萃取物( H2O extract, 220.6公克 )與乙酸乙酯層萃取物( EA extract, 25.9公克 )。取不同溶劑萃取物以乙醇回溶，混合震盪，使之完全溶解，以0.22μm 濾膜過濾，再利用逆相高效能液相層析儀分析，結果如圖4-1.所示，樟芝固態培植體乙醇萃取液的retention time主要在5分鐘前、10~15分鐘、25分鐘及35~45分鐘。經液相分配萃取，水層萃取物的retention time主要在5分鐘前及10~15分鐘，屬於極性較高的成分。而乙酸乙酯層萃取物的retention time則分布在10~15分鐘、25分鐘及35~45分鐘，成分以中、低極性物質為主。從謝(2004)研究顯示，樟芝菌絲體經固態發酵後的萃取物中發現retention time在20分鐘前的成分含量更為豐富，且在retention time 25分鐘及40分鐘皆出現一明顯波峰，有別於樟芝液態發酵液、樟芝液態發酵菌絲體及固態發酵所使用基材的成分，由此顯示這些成分應為樟芝經固態發酵過程所轉化產生的新化學成分。
樟芝固態培植體乙醇萃取液經液相分配萃取，得水層萃取物與乙酸乙酯層萃取物，由圖4-1顯示，中、低極性物質多溶於乙酸乙酯層中。大多數的三萜類都為中、低極性物質且具有共軛體系，故在波長252nm下具有吸收之特性，由此可推測這些經固態發酵過程所轉化產生的新成分中可能含有類三萜物質。
35
(a)
(b)
(c)
圖4-1. 樟芝固態培植體不同溶劑萃取物之HPLC層析圖
(a)樟芝固態培植體乙醇萃取液(ACE) (b)經液相分配萃取之水層萃取液 (H2O layer) (c)經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 (EA layer)
36
4.1.2 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之抑制腫瘤細胞生長試驗
將樟芝固態培植體乙醇萃取物經液相分配萃取(水及乙酸乙酯)，初步將成分區分為水溶性及脂溶性物質，已知三萜類屬於中、低極性物質且具有抑制腫瘤細胞生長的作用，因此推論乙酸乙酯層中的化合物應具有強的細胞毒性。為了證實此理論，我們將樟芝固態培植體不同溶劑萃取物(ACE，EA，H2O)以不同濃度處理人類肺癌細胞（A549 cells）、肝癌細胞(Hep 3B cells)及直腸癌細胞（HCT-8 cells），觀察不同溶劑萃取物對腫瘤細胞的毒殺作用。
(1) 對人類肺癌細胞( A549 cells )之影響
由圖4-2發現，隨著樟芝固態培植體不同溶劑萃取物濃度的增加，對人類肺癌細胞( A549 cells )之存活率皆有降低的影響。結果顯示，乙酸乙酯萃取物抑殺A549細胞的效果優於乙醇萃取物及水層萃取物，在濃度 100μg/mL時，即有50%的抑殺腫瘤細胞之能力，在500μg/mL時幾乎能抑殺95%以上的A549 細胞。水層萃取物抑殺A549 細胞的效果較乙酸乙酯層萃取物差，在100μg/mL濃度下，抑殺A549細胞的能力並不明顯，直到濃度增加至500μg/mL時才有50%的抑殺能力。
(2) 對人類肝癌細胞( Hep 3B cells )之影響
同樣的情形也發生在Hep 3B 細胞上，由圖4-3顯示樟芝固態培植體乙醇萃取物和水層萃取物對Hep 3B細胞的抑殺能力並不明顯，即使濃度在250μg/mL時，細胞存活率分別為77%，98%;反觀，乙酸乙酯萃取物在濃度250μg/ml時，細胞存活率僅有12%。
37
(3) 對直腸癌細胞（HCT-8 cell）之影響
由圖4-4 顯示，樟芝水層萃取物抑制腫瘤細胞生長的能力並不顯著，即使濃度增加至200μg/mL時，細胞存活率皆在90%以上。相對的，乙酸乙酯萃取物在濃度50μg/ml時，即有抑制50%腫瘤細胞生長( IC50 )的效果。隨著作用濃度的增加，腫瘤細胞的存活率也隨之降低，當作用濃度增加至200μg/mL時，幾乎能抑殺95%以上的HCT-8 細胞。
由結果可證實，樟芝固態培植體乙醇萃取物中具有抑制腫瘤細胞生長的成分存在於乙酸乙酯萃取物，屬於中、低極性的物質，一般以水萃取方式獲取的產物對抑制腫瘤細胞生長的效果應有限。而該化合物對於腫瘤細胞的抑殺效果為HCT-8 細胞優於A549 細胞優於Hep 3B 細胞。
38
120.0%ACE100.0%80.0%Cell viabilityEAH2O60.0%40.0%20.0%0.0%50100500controlConcentration (ug/ml)圖4-2. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對A549 cell的抑殺效果。
分別以50、100及500μg/mL不同濃度之不同溶劑樟芝固態培植體粗萃取物處理A549細胞48小時後，對細胞存活率之影響。( ACE:樟芝固態培植體乙醇萃取液，H2O layer:經液相分配萃取之水層萃取液，EA layer:經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 )
39
120.0%ACE100.0%EAH2O80.0%Cell viability60.0%40.0%20.0%0.0%1050100250controlConcentration(ug/ml)圖4-3. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對Hep 3B cell的抑殺效果。
分別以10、50、100及250μg/mL不同濃度之不同溶劑樟芝固態培植
體粗萃取物處理Hep 3B細胞48小時後，對細胞存活率之影響。( ACE:樟芝固態培植體乙醇萃取液，H2O layer:經液相分配萃取之水層萃取液，EA layer:經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 )
40
120.0%100.0%80.0%ACEEAH2Ocell viability60.0%40.0%20.0%0.0%1050100200controlconcentration(ug/ml) 圖4-4. 不同溶劑的樟芝固態培植體粗萃取物對HCT-8 cell的抑殺效果。
分別以10、50、100及200μg/mL不同濃度之不同溶劑樟芝固態培植體粗萃取物處理HCT-8細胞48小時後，對細胞存活率之影響。( ACE:樟芝固態培植體乙醇萃取液，H2O layer:經液相分配萃取之水層萃取液，EA layer:經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 )
41
4.1.3 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之抗氧化能力測定
(1)樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物捕捉DPPH ( α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl , C18H12N6O5 )的能力.
抑制油脂氧化之抗氧化劑通常是藉由提供氫來捕捉油脂的過氧化自由基，故使用DPPH•來檢測抗氧化劑提供氫之能力。DPPH•為一種很穩定的自由基，又因為DPPH甲醇溶液在波長517nm下具有強吸收，在被抗氧化劑(AH)還原或與另一個自由基結合時，會使吸光值降低，由此判斷樣品捕捉DPPH自由基之能力。
DPPH• (violet) + AH → DPPH : H ( decolorized ) + A•
樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物隨著濃度增加 (0.01~1 mg/ml)，捕捉DPPH•能力隨之上升(表1，圖4-5)。於低濃度(0.01 mg/mL)時，樟芝固態培植體乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之捕捉能力並不顯著，當濃度增加至0.5 mg/ml時，三者捕捉DPPH•之能力皆大於95 %，且優於0.01 mg/mL抗壞血酸(捕捉DPPH•之能力為71.2% ) 。整體而言，捕捉DPPH•的效果以乙酸乙酯萃取物最好，在濃度0.1 mg/mL時即有95 %之捕捉能力。
宋(2003)研究顯示樟芝菌絲體甲醇及乙酸乙酯萃取物之抑制脂質過氧化能力均與其粗三萜類含量成正相關，顯示粗三萜類亦有提供菌絲體乙酸乙酯萃取物抗氧化之能力。
42
表4- 1. 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物捕捉DPPH的能力.
Scavenging effect ( % )
(mg/mL) 0.01 0.05 0.1 0.5 1
ACE 7.9+2.0 24.6+1.9 44.2+4.1 94.7+0.2 96.0+0.3 H2O extract 3.5+2.2 20.4+7.6 40.0+8.8 95.0+2.4 96.4+2.0 EA extract 22.4+1.0 81.2+3.2 95.7+0.2 96.6+0.6 96.9+0.2 Scavenging effect (%) = [(A517nm of control - A517nm of sample)/(A517nm of control)] ╳ 100 Each value is expressed as mean + SE (n=3 ). 43
120.0%100.0%Scavenging effect80.0%60.0%40.0%H2O20.0%EAACE0.0%00.20.40.6Concentration(mg/mL)0.811.2
圖4-5. 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物捕捉DPPH的能力。
分別以0.01、0.05、0.1、0.5及1.0 mg/mL不同濃度之不同溶劑樟芝固態培植體粗萃取物進行捕捉DPPH能力之測試。( ACE:樟芝固態培植體乙醇萃取液，H2O layer:經液相分配萃取之水層萃取液，EA layer:經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 )。清除率(%) = [(A517nm of control - A517nm of sample)/(A517nm of control)] ╳ 100
44
(2) 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取液之還原能力 還原力以測定普魯士藍 (prussian blue, Fe4[Fe(CN)6]3)生成量為指標，藉由赤血鹽(prussian ferricyanide, K3Fe(CN)6 )還原成黃血鹽( K4Fe(CN)6 )後，再與三價鐵離子作用生成普魯士藍，並以分光光度計在最大吸收波長700nm下測定普魯士藍含量，用以檢測樣品的還原力。樣品若將鐵離子還原成亞鐵離子，再與三價鐵生成普魯士藍而使吸光值上升，則表示樣品的還原力愈強。
K3Fe(CN)6 + sample → K4Fe(CN)6 + sample-oxide Fe3+ + K4Fe(CN)6 → Fe4[Fe(CN)6]3
樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物隨著濃度增加，還原能力隨之上升(表2，圖4-6 )。樟芝固態培植體乙醇萃取物在低濃度( 0.05 mg/mL)時，還原力為0.18，隨著濃度增加至0.4 mg/mL時，其還原力上升至1.11。經過液相分配萃取所得的樟芝水層萃取物及乙酸乙酯萃取物其還原力皆優於乙醇萃取物，在低濃度( 0.025 mg/mL)下其還原力分別為0.19、0.27，隨著濃度增加至0.2 mg/mL時，其還原力分別上升至0.99、1.66。結果顯示乙酸乙酯萃取物之還原能力最佳，在濃度0.1mg/mL時，其還原力為0.91，相當於0.012mg/mL抗壞血酸之還原能力。
45
表4-2. 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之還原能力.
Reducing power ( Absorbance at 700nm )
(mg/mL) 0.025 0.05 0.1 0.2 0.4
ACE - 0.18+0.064 0.34+0.065 0.57+0.063 1.11+0.064 H2O extract 0.20+0.053 0.29+0.059 0.56+0.083 0.99+0.041 >2 EA extract 0.27+0.070 0.47+0.079 0.91+0.082 1.66+0.066 >3 Each value is expressed as mean + SE (n=3 )46
1.801.601.40Absorbance at 700nm1.201.000.800.600.400.200.0000.10.20.30.40.50.6Concentration (mg /ml)H2OEAACE
圖4-6. 樟芝固態培植體之乙醇、水及乙酸乙酯萃取物之還原能力。 分別以0.025、0.05、0.1、0.2及0.4 mg/mL不同濃度之不同溶劑樟芝固態培植體粗萃取物進行還原能力之測試。( ACE:樟芝固態培植體乙醇萃取液，H2O layer:經液相分配萃取之水層萃取液，EA layer:經液相分配萃取之乙酸乙酯層萃取液 )。
47
4.2 化合物AC-1之纯化
經實驗顯示樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物對人類肺癌細胞A549、人類肝癌細胞Hep 3B及人類直腸癌細胞HCT-8皆具有毒殺效果及有顯著的抗氧化能力，期能以高產量方式篩選出樟芝菌絲體中具有抑制腫瘤細胞生長或抗氧化能力之成分。將樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經正向管柱層析分離，以不同比例之正己烷(Hexane)/氯仿(Chloroform)/甲醇(Methyl alcohol)為移動相沖提液進行梯度分離。每100ml沖提液收集為一瓶，濃縮至乾並秤重，得22個樣品，以乙醇回溶再利用HPLC分析，加以檢視，合併成分相似的樣品，得fraction 4、9、11、14、15、19 (圖4-7)，其收集率分別佔該次充填重量( 2.5 g )的11.1%、10.7%、5.5%、3.0%、4.7%、3.9% (圖4-8 )，未充提出的部分佔60.8%。樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經膠體過濾層析法將成分依極性的不同加以區分，圖4-9中顯示fraction 4的HPLC圖譜中在25分鐘上有一單一且明顯的波峰，其纯度大於90%。比對謝(2004)研究顯示，該成分為樟芝經固態發酵過程所轉化產生的新化學成分，稱之為AC-1。進一步利用製備型HPLC纯化該成分後進行結構鑑定及功能性試驗以釐情該成分之作用。
48
EA extract H:C=9:1 H:C=1:9 C:100%C:M=30:1C:M=14:1 C:M=7:1 Fr.1~2 Fr.3~6 合併F4~6 為F4 AC-1 Fr.7~10合併F9~10為F9 Fr.11~14Fr.15~18Fr.19~22 合併為合併為F19 合併F11~13為F11F 14 F15 H: Hexane C: Chloroform M: MeOH
圖4-7. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析分離之流程圖
49
其他60.8%F4-611.1%F193.9%F154.7%F143.0%F11-135.5%F9-1010.7%F7-80.3%F4-6F7-8F9-10F11-13F14F15F19其他
圖4-8. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析分離所得各個
fraction之收集率
50
圖4-9. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得F4之
HPLC層析圖
51
4.2.1 化合物AC-1之結構鑑定
此化合物係利用矽膠管柱層析法分離纯化，於沖提液為H:C = 1:9時被沖提出來，再以製備型HPLC( 42% ACN )加以分離纯化，得一白色結晶物化合物，其光譜數據如下:
分子式 : C10H12O4 mp : 43 ℃ Rf (圖4-11 ) : 0.71
UV scale (MeOH, 圖4-12 ) :
此化合物在249nm處有強吸收，此化合物應具有共軛的烯類 IR KBr (νmax : cm-1) (圖4-13 ) : 1635 (-C=C-),
2950, 1503, 1448, 1066, 954, 817 cm-1
1
H-NMR (δ,CDCl3 ) (圖4-14 ) :
2.17(d, J=3.2 Hz, ) 3.88(m, J=3.2,2.8 Hz,) 5.94(t, J=2.9 Hz, ) 6.30( s , J=1 Hz, >C=C) :
13
C-NMR-DEPT (400MHz,CDCl3) (圖4-15 ) :
EI-MS (圖4-16 ) m/z : 196 (M)+
52
圖4-10. 化合物 AC-1以分析型HPLC在252nm下分析所得之層析圖譜。
53
圖4-11. 化合物 AC-1之TLC照片
54
3.532.5Absorbance21.510.50200250300350400450Wavelength (nm) 圖4-12. 化合物 AC-1之紫外線全波長(200~450nm)掃描光譜。
55
圖4-13. 化合物 AC-1之紅外線光譜圖
56
圖4-14. 化合物 AC-1之1H核磁共振光譜圖
57
圖4-15. 化合物 AC-1之13C-DEPT核磁共振光譜圖
58
圖4-16. 化合物 AC-1之EI-MS質譜圖
59
4.2.2 化合物AC-1之抑制腫瘤細胞生長試驗
經膠體過濾層析分離所得的fraction 4，更進一步以製備型HPLC纯化，得一白色結晶物，命名為AC-1。將此化合物進行抑制腫瘤細胞生長試驗，分別利用人類肺癌A549細胞、人類直腸癌HCT-8細胞及人類肝臟正常細胞 ( Change liver cells) 和人類肝臟星狀細胞 (HSC cells)，得結果如圖4-17.。結果顯示，細胞的存活率皆會隨著濃度的增加而降低，在低濃度的情況下 ( 25μg/mL以下)，AC-1對於各種細胞抑制生長的效果皆不顯著( 細胞存活率>90 % )，反而有促進正常細胞Change liver細胞及HSC細胞的生長。隨著AC-1濃度增加至100μg/mL時，對腫瘤細胞A549細胞及HCT-8細胞皆有50 %左右的抑制作用( IC50分別為97.27μg/mL及 111.60μg/mL )，對正常細胞Change liver細胞及HSC細胞也有50%左右的抑制作用( IC50分別為101.29μg/mL及106.81μg/mL )。當濃度增加至200μg/mL時，A549細胞、HSC細胞及Change liver細胞的存活率皆小於10%以上。由此結果發現AC-1化合物對A549細胞的毒性較其他三者細胞強，而對HCT-8細胞的毒殺則較不顯著，這與之前不同溶劑樟芝固態培植體萃取液對HCT-8細胞毒殺作用最強的結果有差異;再比對樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取液及AC-1對於抑制腫瘤細胞生長的效果，推論AC-1並非樟芝固態培植體萃取液中最主要的抗腫瘤成分。在正常細胞方面，AC-1在低濃度時對細胞的毒殺並不明顯，當濃度增加至100μg/mL時毒殺作用突然變的急劇，這可能是因為正常細胞在體外培養時較腫瘤細胞脆弱，所以對於濃度效應的傷害也較顯著。
60
140.0%A549HCT-8Chang liverHSC120.0%100.0%Cell viability80.0%60.0%40.0%20.0%0.0%510255075100150200Concentration (ug/mL) 圖4-17. 化合物AC-1對人類肺癌A549細胞、人類直腸癌HCT-8細胞及人類肝臟正常細胞 ( Change liver cells) 和人類肝臟星狀細胞 (HSC cells)抑
制生長之能力
61
4.2.3 化合物AC-1之抗氧化能力測定
(1) AC-1捕捉DPPH之能力.
探討從樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物中分離所得之AC-1化合物補捉DPPH之能力，結果如圖4-18。隨著AC-1濃度的增加，捕捉DPPH之能力亦有上升的趨勢，在低濃度時清除DPPH的能力並不顯著，當濃度增加至5 mg/mL時才具有捕捉50%左右DPPH的能力。對照前面樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物捕捉DPPH的能力，發現清除DPPH的效果相差甚遠，所以推論，AC-1雖具有捕捉DPPH之能力，但效果並不顯著。此結果顯示，樟芝固態培植體萃取液中之抗氧化成分其極性應低於AC-1，亦表示在HPLC圖譜中的位置應該在AC-1以後出現之波峰。
62
80.0%70.0%60.0%Scavenging effect50.0%40.0%30.0%20.0%10.0%0.0%024681012Concentration (mg/mL)
圖4-18. 化合物AC-1捕捉DPPH的能力。
63
4.3 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析
法所得之其他fraction之功能性測定
4.3.1 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個fraction之HPLC分析
將樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經膠體過濾層析所得的fraction以HPLC分析，比較其中成分的差異，結果如圖4-19.。F9的成分以retention time為45分鐘的成分為主，由於F9是由100% chloroform沖提出之收集液，成分屬於極性較低的化合物。比較F11及F14的HPLC圖譜發現，兩者成分組成相似，主要分為10~20分鐘及35~45分鐘兩區域的成分，retention time為10~20分鐘的成分屬於較中極性的化合物，retention time為35~45分鐘的成分屬於極性較低的化合物，不過F11的組成較為豐富但成分含量較少，而其中差異最大的部分，在於F11中retention time 15~20分鐘之間有著F14沒有的成分，其中以retention time 15分鐘該成分所佔的含量最大;而F14在retention time 39~40分鐘之間所存在的成分也是F11沒有的。比較F15與F19的HPLC圖譜發現，兩者的成分組成亦相似，成分的retention time主要為10~15分鐘，不同的是F15中含有一些retention time為30~40分鐘的低極性成分。由此可見，隨著膠體層析移動相極性的增加，所收集到的成分之極性也是由低至高極性漸增。
64
(a) F 9
(b) F 11
(c) F 14
65
(d) F 15
(e) F 19
圖4-19. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個fraction以UV 252nm分析之HPLC圖譜.(a) F9 (b) F11(c) F14 (d) F15 (e) F19
66
4.3.2 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個fraction之抑制腫瘤細胞生長試驗
由實驗結果發現AC-1化合物並非樟芝固態培植體萃取物中最主要的抑制腫瘤細胞生長之成分。故接著探討樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經膠體過濾層析法分離所得其他fraction對抑制人類腫瘤細胞生長之能力，結果如圖4-20.、圖4-21.所示。
(1) 對人類肺癌細胞( A549 cells )之影響
由圖4-20發現，隨著各個fraction濃度的增加，抑制A549細胞生長的能力愈強。以乙酸乙酯萃取物為對照組，結果顯示，以F11抑制A549細胞生長的能力最強，在濃度為50μg/mL時，即能抑制65% A549細胞的生長，當濃度增加至100μg/mL時，已能抑制95%以上 A549細胞的生長( 細胞存活率為2.2% )。其次為F14，在濃度為50μg/mL時，亦能抑制約50% A549細胞的生長，當濃度增加至100μg/mL時，也可抑制90%左右的細胞生長( 細胞存活率為13.7% )。以F19抑制A549細胞生長的效果最不顯著，當濃度達到200μg/mL時才具有抑制50% A549細胞生長之效果。
(2)對人類直腸癌細胞( HCT-8 cells )之影響
由圖4-21顯示，隨著各個fraction濃度的增加，抑制HCT-8細胞生長的能力愈強。同樣以乙酸乙酯萃取物為對照組，結果顯示，以F11抑制HCT-8細胞生長的能力最強，在濃度為10μg/mL時，即能抑制50% HCT-8細胞的生長，當濃度增加至50μg/mL時，已能抑制90%以上 HCT-8細胞的生長( 細胞存活率為8.9 % )。其次為F14，在濃度為10μg/mL時，亦能抑制約50% HCT-8細胞的生長，當濃度增加至50μg/mL時，也可抑制70 %左
67
右的腫瘤細胞生長( 細胞存活率為29.9 % )。相較之下，以F19抑制HCT-8 細胞生長的效果較其他fraction不顯著，當濃度達到100μg/mL時才具有抑制50% HCT-8細胞生長之效果。
綜合以上結果發現各個fraction抑制腫瘤細胞的效果為F11>F14>F9=F15>F19。若配合圖4-19之HPLC圖譜比較，可發現低極性成分含量的多寡與其抑制腫瘤細胞生長的效果呈現正相關，所以F11抑制腫瘤細胞生長的效果會優於F14及F9;再者，除了低極性的成分外，F11中retention time 15~20分鐘的中極性成分含量也較其他fraction高，見圖4-19 (b)所示。故可推論，這類成分或許具有輔助作用，可幫助F11達到抑制腫瘤細胞生長的加乘效果。
68
100.0%90.0%80.0%70.0%EA layerF9F11F14F15F19Cell viability60.0%50.0%40.0%30.0%20.0%10.0%0.0%50100200Concentration (ug/mL)
圖4-20. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
fraction對A549 cell的抑殺效果
69
100.0%90.0%80.0%70.0%EA layerF9F11F14F15F19Cell viability60.0%50.0%40.0%30.0%20.0%10.0%0.0%1050100Concentration (ug/mL)圖4-21. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
fraction對HCT-8 cell的抑殺效果
70
(3) 比較樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物、fraction 11及AC-1化合物 對正常細胞(change liver cells)及腫瘤細胞(A549 cells，HCT-8 cells)抑制生長能力
綜合以上結果，探討不同濃度的樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物、fraction 11及AC-1化合物對正常細胞(change liver cells)及腫瘤細胞( A549 cells，HCT-8 cells)抑制生長能力，如圖4-22所示，隨著樣品濃度的增加，不論是正常細胞或腫瘤細胞對於抑制生長的能力皆具有正向關係。比較不同萃取物對正常細胞及腫瘤細胞抑制生長之能力，得知三者萃取物對於正常細胞的抑殺相較於腫瘤細胞皆有較不顯著的現象，此作用以fraction 11最為明顯。再比較不同萃取物對腫瘤細胞之抑殺能力，發現樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物及fraction 11對於HCT-8細胞抑制生長較A549細胞顯著，而AC-1化合物則對A549細胞的抑制較顯著，這可能與化合物對不同細胞作用的特異性有關。由以上結果推知，fraction 11中應具有抑制腫瘤細胞生長之有效成分。
71
120.0%100.0%80.0%CLA549HCT-8Cell viability60.0%40.0%20.0%0.0%Conc. (ug/mL)105010020010F11501002001050100200Sample nameEA layerAC-1
圖4-22. 樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物、fraction 11及AC-1化合物對肝臟正常細胞(Chang liver cells)及腫瘤細胞(A549 cells，HCT-8 cells)抑制生長
能力之比較。
72
4.3.3 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個fraction之抗氧化能力測定
(1) 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個fraction捕捉DPPH之能力.
樟芝固態培植體之乙酸乙酯萃取物經膠體層析分離後所得之fraction捕捉DPPH之能力如圖4-23.，顯示F11捕捉DPPH之能力較其他fraction佳，當濃度達0.1 mg/mL時，即能清除90 %以上的自由基。其他fraction ( F9，F14，F15，F19 )捕捉DPPH的能力亦隨著濃度增加( 0.05~0.5 mg/mL )，當濃度達0.5 mg/mL時，即能清除80 %以上的自由基。
Huang (1999)研究顯示新鮮及乾燥的樟芝子實體甲醇萃取物，於濃度2.5 mg/mL時，其清除DPPH的能力分別為99.1%及96.3%。Mau (2004)發表的研究中提到，樟芝經液態發酵所得之菌絲體甲醇萃取物當濃度為5.0 mg/mL時，其清除DPPH之能力可達95%以上。對照以上結果顯示，經固態發酵所得之樟芝固態培植體乙醇萃取液捕捉DPPH能力較樟芝子實體與樟芝液態發酵菌絲體佳。
Brand-Williams等人(1995)以DPPH檢測酚酸及其衍生物質之抗自由基活性提出三種假說，認為酚類及其衍生物之所以捕捉DPPH能力較強是因為:1)苯環鄰位上有取代基可以提供第二個氫給DPPH，2)Phenoxyl radicals可以形成二聚物(dimerization)，繼續提供氫給DPPH，3) Phenoxyl radicals可以與DPPH形成複合物。因此F11捕捉DPPH的能力較強，可能與其中含有相似結構成分有關。
73
120.0%100.0%Scavenging effect80.0%60.0%40.0%F9F11F1420.0%F15F1900.10.20.30.40.50.60.0%Concentration (mg/ml)圖4-23. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
fraction捕捉DPPH之能力。
74
(2) 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個 fraction之還原能力
樟芝固態培植體乙酸乙酯萃取物經膠體層析分離後所得之fraction隨著濃度增加，還原能力亦隨之上升(圖4-24.)。圖中顯示F11之還原能力較其他fraction突出，在濃度0.1 mg/mL時，其還原力即可達到1.13。其他fraction之還原能力雖不及F11，但其還原能力仍與濃度呈正比關係，當濃度達0.4 mg/mL時，F9、F14、F15、F19的還原能力分別為0.73、0.89、0.66、0.45。黃(2000)研究中提到，樟芝菌絲體甲醇萃取液中良好的抗氧化能力與其中含有的天然抗氧化成分，如多酚類、α-生育醇及微量的抗壞血酸與β-胡蘿蔔素有關。比對各個fraction之HPLC圖譜發現(圖4-19.)，還原能力與中低極性成分的多寡呈正向關係，因此F11還原能力較強，可能其中含有類似天然抗氧化成分結構之物質。
75
2.500F92.000F11F14F15F19Absorbance at 700nm1.5001.0000.5000.00000.050.10.150.20.25Concentration (mg/ml)
圖4-24. 樟芝固態培植體乙酸乙酯層萃取物經正向管柱層析法所得各個
fraction之還原能力。
76
第5章 結論
本研究的目的為探討經固態發酵所得的樟芝固態培植體乙醇萃取物中具有抑制腫瘤細胞生長及抗氧化效果之成分並鑑定其化學結構式。
首先，研究結果顯示樟芝固態培植體乙醇萃取物經液相分配萃取後，具有抑制腫瘤細胞生長及抗氧化效果之成分多溶於乙酸乙酯層中，屬於中、低極性的成分。針對樟芝經過固態發酵之後大量產生的成分，進而從樟芝乙酸乙酯萃取物中纯化出含量比例較多的成分，纯化所得之化合物代稱為AC-1。該化合物具有抑制腫瘤細胞生長及抗氧化等效果，但效果並不顯著。因此推論，該成分並非樟芝固態培植體乙醇萃取物中主要具有抑制腫瘤細胞生長及抗氧化效果之成分。
接著，針對樟芝乙酸乙酯萃取物其他fraction進行功能性試驗，發現fraction 11具有極佳的抑制腫瘤細胞生長及抗氧化能力之能力，在濃度為50μg/mL時，即能有顯著抑制腫瘤細胞生長之能力;當濃度達0.1 mg/mL時，即能清除90 %以上的自由基及達到九成的還原能力。由此結果可推論fraction 11中應含有類似天然抗氧化成分之物質，才足以表現如此強效的抗氧化能力。另一方面，目前仍無法確認樟芝固態培植體萃取物真正具有抑制腫瘤細胞生長的化合物為何，有待未來做進一步的探討。
77
參考文獻
一、英文文獻：
1. C.H. Chen, S.W. Yang (1995) “New steroid acids from Antrodia
cinnamomea a fungal parasite of Cinnamomum micranthum.” J. Natural Products 58:1655-1661.
2. G.J. Wang , H.W. Tseng , C.J. Chou , T.H. Tsai , C.T. Chen and M.K., Lu.
(2003) “The vasorelaxation of Antrodia camphorata mycelia : Involvement of endothelial Ca2+-NO-cGMP pathway” Life Sciences, 73 , p.2769–2783. 3. H.C. Chiang , D.P. Wu , I-W. Cherng and C.H. Ueng (1995) “ A
sesqiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds form Antrodia cinnamomea ” Phytochemistry 39 (3) p.613-616.
4. H.L. Chang , G.R. Chao , C.C. Chen and J.L. Mau (2001) “Non-volatile
taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps miritaris mycelia”, Food chemistry 74, p.203-207.
5. I.H. Cherng ; D. P. Wu ; and H.C. Chiang. (1996) “ Triterpenoides from
Antrodia cinnamomea ” Phytochemistry 41 (1) p.263-267.
6. I.H. Lee , R.L. Huang , C.T. Chen , H.C. Chen , W.C. Hsu and M.K. Lu
(2002)“Antrodia camphorata polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects”, FEMS Microbiology Letters ,209, p.63-67.
7. I.W. Cherng ; H.C. Chiang; M. C.Cheng and Y.Wang . (1995) “ Three new
triterpenoids from Antrodia cinnamomea ” J. Nat. Prod. , 58 , p.365-371. 8. J. J. Cheng, C. J. Yang, C. H. Cheng, Y. T. Wang, N. K. Huang, and M. K.
Lu (2005) “Characterization and Functional Study of Antrodia camphorata Lipopolysaccharide.” Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53,
78
469-474
9. J.L. Mau , P.N. Huang , S.J. Huang , C.C. Chen (2004) “Antioxidant
properties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia ”, Food chemistry 86, p.25-31.
10. J.L. Mau , P.N. Huang , S.J. Huang , C.C. Chen (2004) “Antioxidant
properties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia ”, Food chemistry 86, p.25-31.
11. L.C. Huang , S.J. Huang , C.C. Chen, and J.L. Mau (1999) “Antioxidant
properties of Antrodia camphorate.” Proceesings of 3rd International Conference on Mushroom. Biology &Mushroom Products. P275-283 12. Norio Nakamura, Akiko Hirakawa, Jiang-Jing Gao, Hiroko Kakuda,
Motoo Shiro, Yasuhiro Komatsu, Chia-chin Sheu, and Masao Hattori (2004) “Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia camphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line. ” J. Nat. Prod. , 67, 46-48.
13. S.W. Yang , Y.C. Shen and C.H. Chen. (1996) “Steroids and triterpenoids
of Antrodia cinnamomea –A fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. ” Phytochemistry 41 (5) p.1389-1392.
14. T.T. Chang and W.N. Chou (1995) “Antrodia cinnamomea sp. nov. on
Cinnamomum kanehirai in Taiwan.” Mycol. Res.99:756-758.
15. Y.C. Hseu , W.C. Chang, Y.T. Hseu , C.Y. Lee ,Y.J. Yech , P.C. Chen , J.Y.
Chen , H.L. Yang (2002) “Protection of oxidative damage by aqueous extract from Antrodia camphorata mycelia in normal human erythrocytes” Life Sciences 71 469–482.
79
二、中文文獻：
16. 王伯徹、黃仁彰 (2002) 靈芝與樟芝之研究與市場面面觀 食品工業 34
(5) : 3-17。
17. 江素瑛 (2002) 樟芝安全性、抗基因毒性及抗過敏性之評估 行政院國
家科學委員會專題研究計畫成果報告。
18. 吳德鵬. 1995. 樟芝微量成分的研究. 國立師範大學化學研究所碩士論
文。
19. 呂鋒洲 (2002) 牛樟芝各抗腫瘤有效成份的分離、純化，誘發腫瘤凋亡
及其作用機轉的研究 行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告。 20. 宋祖瑩.(2003) 樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究. 國立中興
大學食品科學研究所博士論文。
21. 李宛蓁.(2003) 樟芝菌絲體培養與生理活性成分生成之研究. 東海大學
化學工程學研究所碩士論文。
22. 沈立言 (2004) 牛樟芝菌絲體發酵過濾液對人類肝癌細胞株細胞週期
的影響 行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告。
23. 周正仁 (2002) 牛樟芝活性成分之研究 行政院國家科學委員會專題研
究計畫成果報告。
24. 林文川、郭淑卿 (2002) 樟芝之藥理學研究 九十年度保健食品研究開
發計畫成果研究報告。
25. 邵貽沅 (2004) 樟芝色素之研究 行政院國家科學委員會專題研究計畫
成果報告。
26. 邵貽沅 (2004) 樟芝深層發酵液之成分分析 .實踐大學食品營養研究
所碩士論文。
27. 范真绮 (2003) 樟芝固態栽培與液態發酵菌絲體之成分及生物活性之
研究 南台科技大學 化學工程研究所碩士論文。
80
28. 高曉薇.(1991) 台灣靈芝屬新種樟芝之三帖類成分研究. 台灣醫學院天
然物醫學研究所碩士論文。
29. 郭淑卿.(2002) 樟芝發酵液對大鼠肝臟纖維化及胃腸功能之改善作用.
中國醫藥學院中國藥學研究所藥學碩士論文。
30. 陳怡欣.(2002) 牛樟芝發酵過濾液對大白鼠肝臟生理機能之影響. 中國
醫藥學院營養研究所碩士論文。
31. 陳勁初、呂鋒洲 (2001) 靈芝之王 : 台灣樟芝 元氣齋出版社 台北、
台灣。
32. 陳思瑋.(2003) 不同培養時間生產之樟芝發酵液對癌細胞生長之影響.
台灣大學食品科學研究所碩士論文。
33. 陳柏珠.(2004) 高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物. 國
立中正大學化學研究所碩士論文。
34. 程一華.(1994) 樟芝之成份研究. 國立師範大學化學研究所碩士論文。 35. 黃鈴娟.(2000) 樟芝與姬松茸之抗氧化性質及其多醣組成分析. 中興大
學食品科學研究所碩士論文。
36. 楊書威.(1991) 中藥樟芝活性成分之研究. 台灣大學藥學研究所碩士論
文。
37. 葉怡真.(2002) 樟芝對血管內皮細胞之影響及保心血管疾病之機制探
討. 中國醫藥學院營養研究所碩士論文。
38. 臧穆、蘇慶華 (1990) 我國台灣產靈芝屬新種-樟芝. 雲南植物研究 12 :
395 – 396。
39. 劉翠玲.(2002) 樟芝對倉鼠體內脂質代謝與抗氧化狀態之影響. 輔仁大
學食品營養學研究所碩士論文。
40. 蔡雁暉.(2002) 樟芝深層培養液及其多醣體之抗氧化特性. 國立中興大
學食品科學研究所碩士論文。
81
41. 賴慶亮譯。水野卓、川合正允原著 (1997) 菇類的化學、生化學。國立
編譯館。
42. 謝曉惠.(2004) 中草藥發酵產物對抑制腫瘤細胞之功能性評估. 南台科
技大學生物科技研究所碩士論文。
43. 簡秋源、姜宏哲、陳淑貞 (1997) 牛樟菇培養性狀及其三帖類成分分析
之研究，牛樟生物學及育林技術研討會論文集. 林業叢刊第72號:133-137。
44. 嚴貴榮.(2002) 樟芝對STZ誘發高血糖鼠血糖調節與抗氧化之影響. 輔
仁大學食品營養學研究所碩士論文。
82
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容