2020,32(3) : 406 -414,htty：///ww. zjnyxb. cn王元红，邢雪，李传峰，等.猫传染性腹膜炎病毒AH1905株A基因的生物信息学分析及原核表达％ J].浙江农业学报，
DOI： 10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2020. 03. 04猫传染性腹膜炎病毒AH1905株&基因的生物信息学分析 及原核表达王元红1!2，邢雪卩，李传峰2,朱杰2，王勇1!!，刘光清2'**
(1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036； 2.中国农业科学院上上海医研究所，上上200241)摘 要:为了解猫传染性腹膜炎病毒\"feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况，
对新分离的FIPV AH1905株的A基因进行了克隆和序列比对分析，并利用生物信息学软件对A基因编码蛋 白的二级结构进行了预测。最后，将A基因克隆至原核表达载体pGEXATA,在原核细胞中进行表达，并制 备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPVAH1905株的A基因全长1 134 bp，编码377个氨基酸。序列比对
分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷同源性为90.2% -92.4%，氨基酸同源性 为91.8% -93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支，同属于FIPV基因I型。对N蛋白二级结构预测
结果显示，该蛋白具有高度亲水性，其二级结构主要由$螺旋\"h)( 14. 06% )、延伸链(e) ( 15. 12%)*%转角
(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域，存在48个潜在的磷酸化位点，
含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位位2个Th表位。Western blot检测结果证明,N蛋白在大肠 埃希菌细胞中主要以包涵体形式大量表达，相对分子质量约为68 ku,具有良好的反应原性。以上结果可为
进一步开展FIPV的流行病学院分子生物学研究奠定基础。关键词:猫传染性腹膜炎病毒;A基因;原核表达;生物信息学 中图分类号:S855. 3
文献标志码:A 文章编号：1004A524(2020)03-0406-09Bioinformatics analysis and prokaryotic expression of FIPV AH1905 strain N geneWANG Yuanhong1,2, XING Xue1,2, LI Chuanfeng2, ZHU Jie2, WANG Yong\"* , LU Guangqing\"*(1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hget 230036, China ； 2. ShanghaiVeterinarc Research Institute, Chinese Academy cf Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China)AbstracC: To understand the molecular epidemiolocical and genetic vvriation characteristics of feline infectious peri
tonitis virus (FIPV) in China, the N gene of FIPV AH1905 strain was cloned by PCR, and the bioinformatics softwares were used to predict the N protein. Then, N gene was cloned into a prokaryotic vector pGEXAT-1 and was
successfully expressed. The expressed protein was purified, and identified by SDS-PAGE and Western blot. The re
sults showed that the N gene of FIPV, 1 134 bp, encodes 377 amino acids. The molecular bioinformatics analysis
showed that the nucleotide homology and the amino acin homology between FIPV AH1905 strain and the reported
FIPV referenco strains were 90. 2% -92. 4% and 91. 8% -93. 9% , respectively. The phylocenetic analysis showed 收稿日期:2019-0805基金项目：国家重点研发OiJ(2016YFD0500108,2016YFD0501003)'上海市科技兴农创新项目(沪农科创字〔2019〕第3A号)；中央级公
益性科研院所基本科研业务费专项资金(2019JB06)；安徽农业大学研究生创新基金(2019ywA6)作者简介:王元红(1995 — )，女，安徽芜湖人，硕士研究生，主要从事宠物病毒分子生物学研究)E-mail： 806576709@qq.com* 通信作者,刘光清,E-mail: liugq@ shvri. ac. cn;王勇,E-mail: wangyong119@ ahau. edu. cn王元红，等.猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达・407・that FIPV AH1905 belongs to the FIPV gene type I , the same as other isolates in China. The prediction of the see-
ondary structure of the N protein showed that the protein was a hydrophilic stable protein with 14. 06% a-he/n ( h), 15. 12% extended chain ( e) , 3. 71% % turn (t) and 67. 11 % random spiral ( c) . There were no signal peptide region and teansmembeanedomain.Gtmayhaee48 phosphoeyeation sites.Mo eeo ee e, theeemayeoistsioB cee
epitopes, twoCTLepitopesand twoTh epitopes.Themoeecueaeweightoeeopeesed peotein isappeooimateey68 ku,
maineyeopeesed in inceusion bodyeoem with good eeactogenicity.Gn conceusion, thepeesentstudyhassuccesseu ey
eopeessed theNpeotein oeFGPV, and peepaeed themueti-antiseeum, which eaid theeoundation eoeeuetheeeeseaech on
epidemioeogyand moeecueaebioeogyoeFGPV.Key words: feline infectious peritonitis virus (FIPV) ； N gene； prokaryotic expression； bioinformatics猫冠状病毒（Fe/na corongvigls, FCoV ）为不 分节段单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目冠 状病毒科冠状病毒属[1]）基于病毒中和抗体反 应和S基因氨基酸序列的不同,FCoV分FCoV- I
和FCoV- &型2个均可导致猫传染性腹膜炎病毒 （fe/na infectious pegmnitis, FG ）的基因型 %2&。其
中,FCoV- I型毒株感染率高达80% -95% ,而 FCoV- n型毒株感染率只占5% ~20%[3]o携带 FIPV病毒的猫可通过粪便排毒传染同居的猫，也
可经衣服、食皿、寝具、人或昆虫等途径传播⑷）
不同年龄的猫均可感染，老龄猫和1周岁以内的 猫发病率高,且纯种猫发病率高于一般品种的家 均5&，严重危害宠物业及养殖业的健康发展。1963年,Holzworth在美国首次报道FIP。随
着宠物行业飞速发展，世界各地猫群交流日渐频 繁,FCoV现已广泛分布于世界猫群中叫FCoV
基因组全长约为30 kb,编码4种与病毒粒子入
侵相关的保守膜相关蛋白:刺突糖蛋白（S）、小包 膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）叫
冠状病毒N基因相对保守，可作为核酸检测、血 清学检测和流行病学研究的良好靶点叫目前
国外关于FIPV的研究多集中在鉴别诊断和致病
机理上，而关于FIPV在国内的流行情况、早期诊 断，及相应生物制品研发的相关报道均很少 见%9「10&。本研究拟对本实验室分离获得的FIPV
AH1905进行研究,克隆其N基因并进行分析,通
过生物信息学软件预测分析N基因编码蛋白的 结构与抗原表位，并在大肠埃希菌原核表达系统
中表达重组蛋白，制备鼠源多克隆抗体，为FIPV 在中国的流行状况提供参考数据，同时也为进般
步开展FIPV的分子生物学研究奠定物质基础。1材料与方法1.1试验材料和试验动物FIPV AH1905株、pGEX-4T-1载体由本实验
室保存。pMD™19-T载体购自TaKaRa公司。6
周龄SPF级Balb/c小鼠购自上海杰思捷实验动
物有限公司，许可证号码为SCXK （沪） 2018-0004。1-2主要试剂UN1Q-10柱式总RNA抽提试剂盒、SanPrep
柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份
有限公司；M-MLV Reverse TranscOptase 试剂盒,
购自北京索莱宝科技有限公司；Solution I、限制
性内切酶BamH I和EcoR I ,购自宝生物工程 （大连）有限公司；DH5a和Rosseta感受态细胞,
购自北京全式金生物技术有限公司；2 iPhanta
Mao Mastae Mio,购自南京诺唯赞生物科技有限公
司；PBS缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、 ECL试剂盒,购自赛默飞世尔科技（中国）有限公
司;抗His标签的鼠鼠一抗、HRP标签的羊抗鼠
IgG,购自北京中杉金桥生物技术有限公司；弗氏
佐剂，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限
公司。1.3试验方法1.3.1引物设计与合成根据已发表的FPV 79-1146株基因序列（No.
DQ010921）,设计N基因特异性引物:上游,5，-CAG
GATCC ATGGCCACACAGGGACAACG-3'（下划线处
为 BamHI酶切位点）；下游,5，-CGGAATTCTTAGT- TCGTAACCTCATCAATCATCTCAACCTGTGTGTC-3'
（下划线处为EdRI酶切位点）。引物委托生工
生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3.2 N基因的分子克隆按UN1Q-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书
-408 -浙江农业学报第32卷第3期提取FIPV野毒株RNAO取10 \"L提取的RNA
法%⑴对重组蛋白进行纯化。1. 3. 7 Western blot 检测于50 \"L反应体系进行RT-PCR反应，获取cD-
NA,保存于-80 U待用。将纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后，转
PCR 反应体系（50 \"L# : 2 X Phanto Mao
膜,5%脱脂奶粉4 U封闭过夜,TBST漂洗3次后
加入1： 1 000稀释的抗GST标签的鼠源单抗, 37 U孵育1 ho TBST漂洗3次后加入1： 1 000稀
Masteo Mix 25 \"L、ddH2O 20 \"L、DNA 模板 1 \"L,
上下游引物各2 Lo PCR条件：95 U预变性3 min；95 U变性 30 s,55 U退火 30 s,72 U延伸 60 s,共35个循环；72 U再延伸5 min）PCR产物回
\"释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,37 U孵育1 h
后TBST漂洗3次。利用ECL发光试剂盒显色。1.3.8 鼠源N蛋白多克隆抗体的制备收后克隆至pMDTM19-T载体，转化DH5$感受态
细胞，涂布至氨苄性的固体培养基，隔天挑取
阳性克隆提取质粒,命名为pMDTM19-T-A,送至
生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.3.3 A基因的序列分析用DNASTAR软件将分离毒株的A基因序 列分别与GenBank中已发表的FGV国内外代表
株进行核苷同源性比较。1.3.4 A基因编码蛋白的生物信息学分析采用ProtparamSOPMA在线程序分析FGV HF1905株N蛋白的理化性质;利用SOPMA在线
程序分析二级结构;利用SigalP5. 0在线程序预
测信号肽;利用TMHMM2. 0 Serveo在线程序预测
跨膜结构域;利用NetPhos3. 1 S/v/在线程序预
测磷酸化位点；利用DNAStao的Protean程序预 测B细胞表位;利用nHLAPred的ComPred在线
服务器预测CTL表位;利用Proored在线服务器
预测Th表位。1. 3. 5 重组载体pGEX-A构建将pMDTM19-T-A与pGEXPT-1空载体质粒
经内切酶BamH I和EcR I双酶切后连接，转
化，对阳性克隆菌液PCR扩增、双酶切鉴定，将测
序正确的重组质粒命名为pGEX-Ao1. 3.6 重组质粒的诱导表达和蛋白纯化将pGEX-P与pGEXPT-1空载体质粒分别
转化Rosette感受态细胞，接种至氨苄性的固
体培养基，分别挑取单菌落至LB液体培养基。
37 U恒温摇床振荡培养至W00值在0.6〜0.8
时，加入 0.5 mmoL・L_i 的 ITG,于 37 U *220 a min'1诱导表达，取5 \"L样品SDS-PAGE电泳，考
马斯亮蓝染色。对诱导成功的重组菌进行大量
诱导,4 U离心收集样品，于冰浴下超声裂解，分 别收集上清和沉淀分析重组蛋白的可溶性。采 用常规包涵体洗涤、尿素复性及蔗糖浓缩方
以纯化的重组N蛋白免疫6周龄BALB/c
雌鼠。免疫程序参照文献［12 &进行。第4次免
疫后1周,从眼眶采血分离获得多克隆抗体。对 已诱导的重组蛋白和pGEXPPT对照菌蛋白进
行SDS-PAGE电泳，转膜，以制备的多抗血清为
一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行 Western-blot 分析。2结果与分析2. 1 A基因扩增经RT-PCR扩增出的A基因约1 134 bp,与
预期结果相符。测序分析结果表明，与参考毒株
序列相比,未发生碱基突变或缺失现象（图1 ）。2.2 A基因的序列比对分析AH1905株的A基因长为1 134 bp,序列比
对分析表明：AH1905株与各代表株核苷同源 性为90.2%〜92. 4%,氨基酸同源性为91.8%〜
93. 9% °其中，分离株与荷兰的UU34株核昔酸
同源性（92. 4% ）和氨基酸同源性（93.9% ）最高M, DNA分子质量标准;1,阴性对照;2, A基因RT-PCR结果°M, DNA moleculao weight standards; 1 , Ne/ative controi; 2, N
gene RT-PCR results.图1 N基因扩增结果Fig. 1 PCR results of FIPV N gene
王元红，等.猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达-409 -（表1 ）。绘制的系统进化树结果表明，本试验分 组成,分子式为C1868 H2921 N565 O585 S6，相对分子质
量为42 846. 54，理论pI（等电点）值为9.73，不稳
离出的AH1905株与其他FIPV基因I型代表株
处于同一遗传进化分支，并与同一小分支的
''34/'6-日8/''30株亲缘关系最近。而
定系数为38.95 ,平均亲水值\"GRAVY ）为 -1.009,为亲水性稳定蛋白蛋白质，带负电荷的
AH1905株与FCoV- &型经典代表株79-1146亲 氨基酸（Asp + Glu）为44个，带正电荷的氨基酸
缘关系较远，这与核苷同源性（91. 1%）和氨 基酸同源性\"92. 9% ）的分析结果一致（图2） o 2.3理化性质分析（Ac + Lys）为62个，脂肪族系数为53. 53。2. 4二级结构分析利用SOPMA在线程序预测N蛋白的二级结
利用Protparam在线程序分析该毒株N蛋白 构,结果显示,该蛋白的二级结构包括\"螺旋（h, 的理化性质,结果显示,该蛋白由377个氨基酸表1 分离株N基因与不同FIPV参考株的序列同源性分析Table 1 analysis oC N gene sequenco homolccy between isolated strains and dmerent FIPV referenco strains参考株名称登录号N基因核昔酸N基因氨基酸StrainGenBank 同源性同源性accession
NucleotideAmino acidNo.sequencc
sequencc honKCocy/%honKCocy/%DF-2 R3-/Q40898091.193.1UG-AH8KX72252992.392.3UU9F/93806292.292.1UU10F/93805990.292.3UU11F/93805290.291.8UU30HQ39247291.492.3UU34HQ01237292.493.9UU54/N18388390.692.179-1146DQ01092191.192.9DF-2DQ28638991.192.9HLJ/HRB/2016/10KY56620992.092.3HLJ/DQ/2016KY58733792.291.8XXNMN16510791.592.6BJ/2016/01KY56620590.791.8UG-FH8• AH1905-------UU30UU34
rUU101— UU11 >FIPV- I 型—UU9UU54■XXNHLJ/DQ/2016
■HLJ/HRB/2016/10 --------------BJ/2016/01
rDF-2 FIPV-II 型1—79-1146 DF-2-R3i0.01•表示本试验分离毒株。• represented the strains isolated in this study.图2分离株N基因与不同代表株核昔酸系统进化树Fig. 2 Phylocenetic tree oC FIPV isolates based on N gene
14.06%）、延伸链（e, 15. 12%）、# 转角（t,3. 71% ）、无规则螺旋（o,67. 11% ）4种类型。2.5信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点的预测
分析分别利用 SingtP5.0 和 TMHMM2. 0 Server
在线程序预测该蛋白的信号肽和跨膜结构域。 结果显示,N蛋白无信号肽区域和跨膜结构域。
利用NetPhos3. 1 Server在线程序预测N蛋白的
磷酸化位点，结果显示，该蛋白共有48个潜在的
磷酸化位点，其中，丝氨酸位点30个，苏氨酸位
点16个，酪氨酸位点2个。2. 6 B细胞抗原表位的预测分析利用DNAStar的Protean程序预测N蛋白的 B细胞抗原表位（图3、表2 ））结合该蛋白的二
级结构、亲水性、柔韧性、抗原性和表面可及性进 行综合分析，该蛋白第62〜67、81〜86、160〜
167、172〜190、313〜318、331〜340处可能存在
优势抗原表位。2.7 T细胞表位的预测分析2. 7. 1 CTL表位预测利用nHLAPred的ComPred在线服务器，将
阈值调节为0.5 ,分别预测HLA-A2、HLA-A *
0201、HLA-A * 0202、HLA-A * 0203 和 HLA-A *
0205共5种分子的结合肽（表3）,结果显示，第
1 - 9位的 MATQGQRVS和276〜280位的 CVPSV可能存在N蛋白的CTL表位。2.7.2 Th表位预测分析利用ProCred在线服务器分别预测DRB1- 0101、DRB1-0102、DRB1-0301 的 Th 表位（表 4）,
结果显示，第47〜55位的FWNLCPRDF和76〜
84位的FRIVKGQRK可能存在N蛋白的Th
表位。2. 8重组蛋白的SDSAAGE分析-410 -浙江农业学报第32卷第3期□ Scale■ Alpha, Regions-Garnier-Robson■ Alpha, Regions-Chou-Fasman■ Beta, Regions-Garnier-Robson■ Beta, Regions-Chou-Fasman口 Turn, Regions-Garnier-Robson■ Turn, Regions-Chou-Fasman0 Hydrophilicity Plot-Kyte-Doolittle■ Alpha Amphipathic Regions-Eisenberg■ Beta Amphipathic Regions-Eisenberga Flexible Regions-Karplus-Schulza Antigenic Index-Jameson-Wolf□ Surface Probability Plot-Emini图3 FIPV N蛋白的B细胞表位预测Fig. 3 Prediction ot B cell epitopes ot FIPV N protein表2 FIPV N蛋白中B细胞抗原表位的位置预测Table 2 Prediction ot location ot B cell epitopes in FIPV N protein方法Method二级结构Secondae stecture位置 Position3 〜6,15 〜18 ,22 〜29,42 〜45 ,51 〜54,56 〜59,62 〜80,81 〜103,109 〜119,123 〜126,131 〜134,141 〜144,148 〜157,160 〜167,172 〜204,208 〜211,215 〜218,220 〜223,227 〜230,238 〜241,244 〜247,252 〜255,257 〜260, 263 〜266,271 〜307,309 〜310,313 〜326,331 〜340,351 〜364,369 〜3771 〜34,38 〜42,44 〜89,98 〜110,118 〜191,201 〜248,250 〜256,260 〜262,266 〜269,271 〜272,288 〜301,305 〜 352,362 〜370,374 〜377,303亲水性Hydrophilicity
柔韧性 Flexibility5 〜8,12 〜31,40 〜45 ,52 〜67,80 〜86,96 〜110,122 〜147,153 〜190,202 〜230,233 〜243 ,249 〜251,255 〜260,263 〜265,279 〜281,286 〜290,292 〜299,309 〜318,327 〜351,364 〜367,199,362,374抗原性 Antigenicity表面可及性Sueeacepeobaett
2 〜10,12 〜32,40 〜48,51 〜67,69 〜70,74 〜75,77 〜88,96 〜110,116 〜147,151 〜190,200 〜242,246 〜260,264 〜266,286 〜299,307 〜318,323 〜353,363 〜3771 〜377综合分析 Parameter analysis62 〜67 ,81 〜86,160 〜167,172 〜190,313 〜318,331 〜340表3 FIPV N蛋白的CTL细胞表位预测续表 3 Continued Table 3Table 3 Prediction ot CTL cell epitopes in FIPV N protein等位片段AlleleHLA-A2等位片段AlleleHLA-A* 0203顺序Rank起始位置Stai position1序列Sequence顺序Rank起始位置Stai position序列Sequence111265MATQGQRVSNAAQCYPQL23HLA-A* 0205231494MATQGQRVSATQGQRVSWKTSQFLEQP23272QLAECVPSV1FLGTGPHADHLA-A * 0201132269PLSFYNPIPCYPQLAECVQLAECVPSV23143276GKPPPQFQLCVPSVSSVLKPEELSVTL2327228343484VLFGSQWSAMATQGQRVSATQGQRVSWHLA-A * 0202112将鉴定正确的pGEX-N质粒转化至大肠埃
23希菌Rosetta细胞内，成功表达出相对分子质量约
为68 ku的重组蛋白，SDS-AGE检测结果显示，355TLVEAYTDV王元红，等.猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达表4 FIPVN蛋白的Th细胞表位预测Table 4 Prediction Th cell epitopes in FIPV N ProteinDRB1-0101-411 -DRB1A102DRB1-0103顺序Rank起始位置StaetPosotoon序列SequenceFRIIKGQRKYFLGTGPHAWNRQVRFRIFWNLCPRDF顺序Rank起始位置StaetPosotoon序列Sequence顺序Rank起始位置StaetPosotoon138114序列SequenceLKFDGK8PPVARDGAMNK1759217546FRVKGQRKFWNLCPRDF1232323694624424490FYGARSASAFFYFLGTGPLSFYNP8TL362
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 DEVTN259192028292VLFGSQWSAYFLGTGPHAVFWVARDGAFYFLGTGPHYNPTLESGFVPKGGNK2122168VSRNRSQSRVKGQRKELA21221113447284FYNPTLES22237819230912324WNLCPRDFVFGSQWSAEE2425VAVLEKLGPLSFYNP8VKVTLTHTY23243554196260252627282VLFGSQWSAYNPTLESGFLGTGPHAD297252627LEKLGVTDKVANGNAAQC359326272815014434LEANRSRNNPPQFQLEAFYNP8TLESFGSQWSAEELEKLGVTDKFLGTGPHAD168297299276282930368168326VEM8DEVTN282930VSRNRSQSRVKVTLTHTYVSRNRSQSRWPSQVAKEQ293031284VTLTHTYYLVPSVSSVLF19693272313278232VKGQRKELAWKKTAGKGD8VAVLEKLG8PLSFYNP83132351LSVTLVEAYLAECVPSVSLSFYNP8TL3233LAECVPSVS272323334192302970MATQGQRVS3334343573199VRFRVKGQLGVTDKQRS35330891203536VKVTLTHTY353637VTLVEAYTD8PLSFYNP8WFFYFLGTG150LEANRSRNNMNKPTTLGT表达的蛋白主要以包涵体存在于菌体沉淀中
蛋白能够被抗N阳性血清特异性识别\"图5-B）。（图 4）。2. 9 Wester blci鉴定结果3讨论2019年5月，安徽省合肥市某动物医院有一 6月龄病猫腹围异常增大,腹腔充斥淡黄色黏稠
利用Western blct对蛋白进行进一步分析,结
果显示，在硝酸纤维素膜上约68 ku处有一特异性
条带，表明重组蛋白能成功被抗GST标签的一抗 识别，具有良好的反应原和（图5-A）。纯化蛋白的
鼠源抗N阳性血清为一抗、HRP标签的羊抗鼠 IgG为二抗进行Western blci鉴定，结果显示，重组
积液,血常规检查显示白蛋白升高，治疗无效后
死亡。经畜主同意剖检后,可见患猫体内大部分 脏器的浆膜层出现纤维蛋白性沉积及肉芽型水-412 -浙江农业学报第32卷第3期自2003年灵猫科动物果子狸将“非典”
(SARS)传播至全球之后,人们对冠状病毒的研 究越来越重视%⑶。FGV作为同属$-冠状病毒属
的重要成员，其引发的FI在感染早期无特征性
症状，出现临床症状后病畜多以死亡结束转 归%⑷，因此FG的早期诊断和疫苗研发尤为重 要。目前，国内外的主要研究方向主要集中在
FGV的鉴别诊断上，而对于FG的流行病学调查
和相关生物制品的研发较少众所周知,
M,蛋白分子质量标准;1,未经诱导的PGEXPT-1质粒;2,经诱
导的PGEXPT-1质粒;3 ,诱导表达的重组N蛋白（细菌沉淀）； 4，诱导表达的重组N蛋白（细菌上清））M, Protein moleculao weight standards ； 1 , pGEXPT-1 was not in
duced ；2, pGEXPT-1 was induced ； 3 , The recombinant plasmid
pGEX-P induced expression （ E. coli precipitate # ； 4, pGEX-P induced expression （ E. coii supernatant）,图4 pGEX-P蛋白产物SDS-PAGE电泳Fig. 4 SDS-PAGE electrophoresis of protein product ofpGEXPNM,蛋白分子质量标准；1,诱导表达的重组N蛋白；2,诱导的
pGEXPT-1质粒;3 ,诱导表达的重组N蛋白；4,诱导的pGEX-
4T-1质粒。M, Protein moleculao weight standards ； 1 , The recombinant plasmid
pGEX-N was induced ； 2, The plasmid pGEXPT-1 was induced ； 3 ,
The recombinant plasmid pGEX-N was induced ； 4, The plasmid pGEXPT-1 was induced.图5 Westorn blot鉴定结果Fig. 5 Western blot identification results肿，初步判定为FIP。为进一步确诊病原,本试验 采集肝脏病料，利用RT-PCR方法扩增疑似FGV
的N基因并进行序列比对分析。RT-PCR扩增结 果显示，成功扩增出与预期大小相符的目的基因 条带,证实该猫携带FGV病原。冠状病毒的侵袭依靠多种蛋白的协同作用。N
蛋白作为FIV的核蛋白保护病毒RNA基因组,
介导病原体的转运及出芽,与病毒的增殖息息相
关%⑻。因此,本研究以最近分离的FIV AH1905
株为模板成功克隆出N基因,经核苷序列比对
发现与2010年荷兰分离株UU34株的核昔酸
(92. 4% )和氨基酸(93.9%)同源性较高，而与
FGV经典株79-1146的核昔酸(91.1%)和氨基
酸(92.9%)同源性较低。绘制的遗传进化树表
明,AH1905株与国内主流毒株在同一分支，属
FGV基因I型，但与国外的UU34、UG-PH8、 UU30亲缘关系较近，而与国内流行的XXN、 HLJ/HRB/2016/10 及 HLJ/DQ/2016 亲缘关系较
远。合肥地区FGV的基因型与国内外参考毒株 遗传进化存在较大差异；因此，应尽快对我国猫
群进行调查分析，了解不同地区FIV的流行情
况,为我国FIV的分子流行病学调查提供信息。对该基因编码的蛋白进行生物信息学分析,
预测N蛋白为亲水稳定蛋白，无信号肽结构。无 信号肽结构的蛋白更易形成包涵体%⑼，这与 SDS-PAGE检测结果相一致。N蛋白不存在跨膜
结构域,有48个潜在磷酸化位点,其二级结构内
无规则卷曲和$螺旋结构较多，％折叠较少。%
折叠和无规则卷曲区域的二级结构比较松散,稳 定性差,更易于盘旋和扭曲，容易与抗体分子结 合%20&，结合亲水性、柔韧性、抗原性、表面可及性
等参数分析，在第62〜67、81〜86、160〜167、172〜
190、313〜318、331〜340处可能存在B细胞优势
抗原表位，同时在第1〜9、276〜280位存在潜在
CTL优势表位，在第47〜55位和76〜84位存在
潜在Th优势表位，提示N蛋白具有良好的抗原 特性,具有作为理想的抗原识别区域和亚单位疫
苗的潜力。进一步对N基因进行原核表达，构建
王元红，等.猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达-413 -pGEX-N重组质粒，经诱导表达可见大小约68 ku
gery, 2009, 11(4) : 225 -258.%9] RIPZ S, EGBERIPK H, HARTMANN K. Effect of feline in
的蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot结
果显示，该蛋白能与鼠鼠抗FIPV血清发生特异 性免疫反应，表明FIPV N蛋白具有良好的特异 性和抗原性，进一步证明N蛋白可以作为检测抗
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原的靶标。总之，本研究首次对安徽合肥地区的FIPV N
基因进行序列分析，可为FIPV的流行病学研究 提供一定的参考。通过生物信息学方法对FIPV etneCoeonaeteustn eeustonsoecaiswtih and wtihouieeetne tneecitouspeetiontitsustngeoop-medtaied tsoiheemaeampetet- caiton% J] . Jguonaog3VcogoggciaoMeehgde 2018! 256:32 -
36.
%11]王勇，赵玉洁，杨侃侃，等.口疮病毒020基因的克隆、
N蛋白进行生物信息学分析，初步预测了 N蛋白
的结构和功能、潜在的B细胞抗原表位，以及
HLA抗原肽和MHC抗原肽。同时制备了 FIPV N蛋白和鼠鼠多克隆抗体等珍贵的生物材料，为
下一步深入研究该蛋白的结构与功能奠定了基
础，同时也为日后FIP的早期诊断和亚单位疫苗
的研究提供了物质基础。参考文献(Refereeces):% 1 ] FLOREK D, EHMANN R, KRISTEN-BURMANN C, et al. I
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