安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２０１２，４０（３１）：１５１３９—１５１４１ 责任编辑朱琼琼责任校对 卢瑶 多聚磷酸盐激酶（ＰＰＫ）基因植物表达载体的构建 曹访，杨志红 ，韩志萍，杨倩，费佳玲 （湖州币范学院，浙江湖州３１３０００） 摘要［目的］构建融合表达ＰＰＫ和绿色荧光蛋白的融合表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ。［方法］根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的大肠杆菌Ｐ尸Ｋ 基因序列（ＩＤ３７１９）设计引物，以Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＩ－Ｉ５ｃ￣基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得ＰＰ 基因，然后用Ｉｎ—Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ’Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ将 ＰＰ 基因克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２载体的Ｎｃｏ Ｉ酶切位点。［结果］序列测定结果显示，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ含有约２．０ ｋｂ的 基因片 段．说明ＰＰ 基因已插入植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２的绿色荧光蛋白基因前。［结论］成功构建了融合表达ＰＰＫ和绿色荧光蛋白的融 合表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ。 关键词 大肠杆菌；多聚磷酸盐激酶基因；植物表达载体；构建 中图分类号Ｓ６０３．６ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６１１（２０１２）３１—１５１３９—０３ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ．ｂａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ ＣＡ０ Ｆａｎｇ ｅｔ ａｉ （Ｈｕｚｈｏｕ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｃｏｌｌａｇｅ，Ｈｕｚｈｏｕ，Ｚｈｅｉｉａｎｇ ３１３０００） Ａｂｓｔｒａｃｔ 『Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅ ａｉｍ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（ＰＰＫ）ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＦＰ）ｇｅｎｅｓ．『Ｍｅｔｈｏｄ］Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＰＫ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｌ０３７１９）０ｆ Ｅ．ｃｏ如ＤＨ５ｄ ｉｎ Ｇｅｎｂａｎｋ．Ｇｅ－ ｎｏｒｎ］ｃ ＤＮＡ ０ｆ ．ｃＤ ＤＨ ５ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＫ ｇｅｎｅ ｂｙ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｉｎ—Ｆｕｓｉｏｎ＠ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，ｔｈｅ ＰＰＫ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｎｃｏ Ｉ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ ｖｅｃｔｏｒ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ２．０ ｋｂ ｌｏｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰＰＫ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ—ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ ｉｎ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ＧＦＰ ｇｅｎｅ．１ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉ Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＰＫ ａｎｄ ＧＦＰ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ：ＰＰＫ ｇｅｎｅ；Ｐ１ａｎｔ．ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ 聚磷是由３～１ ０００多个不等的正磷酸盐通过高能磷酸 １．２．２ ＰＰＫ基因ＰＣＲ引物的设计及扩增。根据ＧｅｎＢａｎｋ 键连接而成的线性多聚体 ，由多聚磷酸盐激酶（Ｐｏｌｙｐｈｏ— 中的大肠杆菌ＰＰＫ基因序列（登录号：Ｉ１）３７１９），用ｐｒｉｍｅｒ ｓｐｈａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ，ＰＰＫ）催化而成。自然界中很多的微生物都有 ｐｒｅｍｉｅｒ５．０辅助设计一对ＰＣＲ引物： 从环境中聚磷的能力，但大部分聚磷能力有限，或需厌氧和 Ｐ１：５＇－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＡＣＡＴＣＧＡＡ一３ 好氧交替的环境才能有效地聚磷。有研究表明，携带有ＰＰＫ Ｐ２ ５＇－Ｃ ＧＣＣ ＧＧＧｑＴＣＡＧＧＴＩＧＴＦＣＧＡＧＴＧＡＴＦｒＧＡＴ— 基因质粒的微生物或植物能过量的吸收环境中的磷酸盐形 ＧＴＡＧ－３ 成大量聚磷，从而用于去除或降低废水中的磷 ，或利用 上游引物Ｐ１位于ＰＰＫ基因序列起始密码子ＡＴＧ位置， 聚磷的络合能力去除环境中的重金属污染 “ 。笔者从Ｅ． 下游引物Ｐ２位于ＰＰＫ基因３ 端终止子ＴＡＡ前，上下游引物 ｃｏｌｉ ＤＨ５ｏ￣基因组中克隆出ＰＰＫ基因，通过基因二［：程技术构 均引进了限制性酶切位点Ｎｃｏ Ｉ（下划线部分），同时下游 建了ＰＰ 基因的植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ，并通过 Ｎｃｏ Ｉ酶切位点的ＡＴＧ还可作为载体上ＧＦＰ基因的起始密 冻融法将其导入根癌农杆菌中，为进一步研究转ＰＰＫ基因 码子，并添加了碱基Ｇ进行补齐，以保证 Ｐ基因不移 植物的聚磷能力奠定基础。 码 。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。ＰＣＲ反 １材料与方法 应体系参照ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒｒａｓ说明书，反应条 １．１ 材料 件为：９５℃５ ｍｉｎ；９８℃１０ ｓ，５５℃１０ ｓ，７２℃１．５ ｍｉｎ，３０个 １．１．１ 菌种和质粒。大肠杆菌受体菌株ＤＨ５ｃ￣和ＪＭ１０９、 循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。 植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２、农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４均由湖 １．２．３ 植物表达载体的构建。用限制性内切酶Ｎｃｏ Ｉ对植物 州师范学院细胞工程研究所提供。 表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２进行酶切，切胶回收约ｌ０．５ ｋｂ的 １．１．２ 主要试剂。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒｒａｓ、 ＤＮＡ片段，对ＰＰ 基因的ＰＣＲ产物也进行切胶回收；然后使 ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｕｉｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．３．０、Ｉｎ—Ｆｕ— 用Ｉｎ—Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ将目的基因和载体进行连接，５０ ｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ等试剂均购自ＴａＫａＲａ公司；细菌基因 ℃下连接１５ ｍｉｎ，产物转化至Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９感受态细胞，涂布于 组ＤＮＡ提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。 含Ｋａｎ（３０ ｇ／ｒｎ１）抗性的ＬＢ平板上，３７℃过夜培养。 １．２方法 １．２．４ 测序引物的设计与测序。根据目的基因插入位点前 １．２．１ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５基因组ＤＮＡ的提取。按照北京百泰克生 后的载体序列设计一对测序引物： 物技术有限公司细菌基因组提取试剂盒说明书操作。 Ｐ３：５ 一ＧＡＣＴＣＴｒＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡ—ＧＣＴＡＴＡ— ＣＡ ｒＣ＿３ 基金项目 国家自然科学基金（３１０７０４５１）；浙江省钱江人才计划项目 （２００９Ｒ１００１６）；浙江省自然科学基金（Ｙ５１１００５７）。 Ｐ４：５ 一ＧＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＩ＇ＣＡＧＧＴｒＧＴ—ＴＣＧＡＧＴ— 作者简介 曹访（１９８０一），男，江苏丰县人，实验师，硕士，从事植物转 基因技术的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃａｏｆａｎｇ＠ｈｕｔｃ．ｚｊ．ｅｌｌ。 通讯作者， ＧＡＴ一３ 讲师，博士，从事植物转基因技术的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎｇｚｈｉｈｏｎｇ 挑取阳性克隆单菌落，转接于含Ｋａｎ（３０ ｇ／ｍ１）抗性的 ＠ｈｕｔｃ．ｚ．ｃｒ１ 收稿日期 ２０１２－０８－２８ 液体ＬＢ培养基中，３７℃下过夜培养，提取质粒送英潍捷基 １５１４（） ２（）Ｉ２年 （上海）贸易有限公刊测 ２．２植物表达载体的构建及鉴定 挑取 陛免隆单菌落． 接种于含３０ ｇ／ｍｌ Ｋａｎ的ＬＢ液体培养綦巾，３７ ｃ【：过伎培 养，碱裂解法提取质粒，经ＰＣＲ和 、 １酶【］ｊ 定，电泳结果 ｍａｓ２．３１等软件进行分析 １．２．５ 表达载体质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ冻融法转化根 癌农杆菌 将０．１ Ｉｘｇ纯化的植物表达载体质粒加入到ｌｏ０ ＬＬｌ农杆菌感受态细胞中，轻轻混 Ｊ，冰Ｊ 放置１０ ｒａｉｎ，于液氯 巾速冻５ ｒａｉｎ，立即川２８℃水浴热澈５ １１１ｉｎ，７ＪＪ】入５００ Ｉｘｌ无抗 与预期大小相符（『纠２），幸玎步判定载体构建 确 测序结果 表明（图３），插入到ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２巾的Ｐ，’ 基 序列与 ＧｅｎＢａｎｋ登录的ＰＰＫ基 序列的同源性为９９．９％（ ７３５ Ｉ，ｐ 生素的ＹＥＢ液体培养基，２８℃缓慢振荡培养２～３ ｈ，然后取 ｝｝｛１００ ｌ菌液均匀涂布 禽有Ｋａｌ 的ＹＥＢ选择平板培养基 上，２８℃下培养４８ １１ ２结果与分析 和１ ５４７ ｂｐ处分别有Ｔ—ｃ、Ａ—Ｃ的突 ），｝｛＿ｊ雨人方向为 向插入，可进行后续的表 斌验试验上掉１ 编码Ｉ＇ＰＫ篮ｒＩ 基因的终止了ＴＡＡ，使得，ｊ， 坫 干¨ＧＦＰ屣 在同一个开 放阅渎框内，可实现这２个基 的融合丧达（ ４），ＧＦＰ蛋 ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶 一可为检测ＰＰＫ毖 在转基 值物『Ｉｌ的表达提供容易检测 的转基因分子标记、 Ｍｌ １ ， ３ Ｍ２ ２．１ ＰＰＫ基因的ＰＣＲ扩增电泳后发现，所扩增片段约２．０ ｋｌ，，与预期大小卡Ｈ符（冈１）， 且条带特异性良好，ｒ ｆ Ｈｊ于进行后续试验 Ｍｌ ５ ０００ ｂＩ１ ０ ０００ ｂｐ ７ ５００ ｂｐ ２ ０００ ｂｐ ４ ３６１ ｂｐ ２ ３２２ ｂｐ ２ ０２７ ｂＯ ５ ０００ ｂＤ ２ ５００ ｂ【】 ２ ０００ ｂ。 １ ０００ ｂＤ ０（）ｂｐ ｝Ｏ ｂ１］ Ｍ１．ＤＩＪｌ５００（）ＤＮＡ Ｍｍｋｆ Ｊｌ：Ｍ２．Ｉ）１２（ｘｍ Ｉ）Ｎ Ｍｍ ｔ：Ｉ．１’ｒＫ Ｍ１．［／１２０（１０ ＤＮＡ Ｍｍｋｍ’；１、２ ＰＰＫ ＰＣＲ产物；Ｍ２． —ｔｔｉｎｄ １１１ 酶切Ｊ ：物 图１ ＰＰＫ基因的ＰＣＲ扩增结果 ＮｃｏＩ ＰＣＲ产物：２ ％ＭＢＩ 、ｌ３０２一 Ｋ幔粒；３．Ⅵ‘０ Ｉ Ｉ丫Ｌ酶 ｐＣＡＭ１３ＩＡＩ３０２一ＰＩ Ｋ 图２重组载体ｐＣＡＭＢＩＡＩ３０２一ＰＰＫ的鉴定 ｃ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ ｃ ＴＧ Ａ ＣＥ三三三盈ｌ Ｇ Ｔ ｃ＾矗Ｇ土Ｇ Ｔ ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ 。ｒｌ＝’＾Ｔ Ｇ ＾ ＿ －． Ｉ ？ｌＩ 肌帆ｖ ：Ｓｃｏ ｉ 球』ＩＩ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ａ矗Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ａ ＣＡ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ ｃ叵 匿 匝囝Ｇ Ｃ Ｔ“Ｔ Ｌ——— —一图３重组载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ部分测序结果 ２．３ 农杆菌的转化及鉴定ＨＪ冻融法将ｐＣＡＭＢＩＡ一１３０２ 质粒转化农朴菌ＬＢ＇＼４４０４，２８ Ｆ＇ｔＰｉ本４８ Ｉ１ ，挑收，Ｔ，－Ｉ￣Ｉ落 ４０卷３１期 曹访等 多聚磷酸盐激酶（ＰＰＫ）基因植物表达栽体的构建 １５１４ｌ Ｎｃｏ Ｉ Ｎｃｏ Ｉ 该试验以植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２为基础，成功构建 了ＰＰＫ基因的植物性表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ。ｐＣＡＭ－ ＢＩＡ１３０２植物表达载体插入有 １尸基因序列，在克隆ＰＰＫ基 ＬＢ ＣａＭｖ ３５Ｓ ＣａＭｖ ３５Ｓ ＰＰＫ越ＦＰ５ Ｉ｛Ｂ 因的引物设计时，删除了编码ＰＰＫ蛋白基因的终止子．ｒＡＡ，使 图４ Ｐ脉基因植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２一ＰＰＫ的构建 得ＰＰ 基因和Ｇ 基因在同一个开放阅读框内，以实现这２ 个基因的融合表达，ＧＦＰ蛋白可为检测ＰＰＫ蛋白在转基因植 物的表达提供容易检测的转基因分子标记。目前，笔者已将构 建好的ＰＰＫ基因重组植物表达载体成功地转入了根癌农杆菌 中，转基因植物的制备工作正在进行之中。 ２ ０００ ｂｐ １ ０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ 参考文献 『１］ＳＴＥＰＨＥＮ Ｊ，ＤＩＥＮ Ｖ，ＫＥＡＳＩＪＮＧ Ｊ Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｌｅ ｍｅｔａｂｏ— ｌｉｓｍ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊｊ．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，２４（１／２）：２１—２５． 『２］ＯＧＡＷＡ Ｎ，ＴＺＥＮＧ Ｃ Ｍ，ＦＲＡＬＥＹ Ｃ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ：ｇｅｎｅｔｉｃ．ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２Ｏ０Ｏ，１８２（２３）：６６８７—６６９３． 『３］ＧＡＶＩＧＡＮ Ｊ Ａ，ＭＡＲＳＨＡＬＬ Ｌ Ｍ，ＤＯＢＳＯＮ Ａ Ｗ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｏｓ— ｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｅｔｅｒ ｂａｕｍａｍｄｉ ２５２［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉ‘ 注：Ｍ．ＤＩ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～４．ＰＰＫ ＰＣＲ产物。 ｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５：２９３１—２９３７． 图５农杆菌单茵落ＰＣＲ鉴定 进行菌落ＰＣＲ，电泳结果显示（图５），４个克隆均显示一条约 ２ ０００ ｂｐ的ＰＣＲ扩增条带，说明重组植物表达载体已成功转 化农杆菌。 ３讨论 ［４］王勤，赵 顷，肖琳，等．转聚磷激酶基因的大肠杆菌去除水体中的磷 ［Ｊ］．中国环 毫科学，２ＯＯ６，２６（６）：７４２—７４５． ［５］管莉菠，蔡天明，李波，等，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧＭ６多聚磷酸盐激酶 （ｐｐｋ）基因的克隆及表达［Ｊ］．土壤学报，２００７，４４（４）：７２７－７３３． ［６］ＡＲＣＨＩＢＡＬＤ Ｆ ｓ，ＦＰｄＤＯＶＩＣＨ Ｉ．Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔ ａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｕｌａｎ－ ｇａｎｅｓｅ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｈａ￣ｐｌａｎｔａｒｕｍ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｅｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９８２，２１５： ５８９—５９６． 水体的富营养化是水体污染的主要原因之一。而水体中 氮磷营养物质不断积累和部分藻类及水生生物过度繁殖，最终 导致了水体的富营养化。当前，如何利用生物生长过程中吸收 氮磷营养物质这一自然过程来达到去除氮磷的目的，已成为研 ［７］ＰＡＮ ＨＯＵ Ｈ，Ｋ／ＹＯＮＯ Ｍ，ＫＡＷＡＳＥ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｐｋ ｓｐｅｃｉｉｆｅｄ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｓ ａ ｍｅｒｃｕｒｙ ｒｅｍｅｄｉａｌ ｔｏｏ］［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，２００１，２４： １４２３—１４２６． ［８］ＰＡＮ ＨＯＵ Ｈ，ＫＩＹＯＮＯ Ｍ，ＯＭＵＲＡ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔ ｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｎｆｅｒｓ ｍｅｒｃｕｒｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ－ ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２０Ｏ２，２０７：１５９—１６４． ［９］ＴＡＫＥＳＨＩ Ｎ，ＭＡＳＡＫＯ Ｋ，ＨＩＤＥＭＩＴＳＵ Ｐ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｃ— ｔｅｆｉａｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｏｒ ｍｅｒｃｕ１＇ｙ ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ ．究的热点。ＰＰＫ是生物积累环境中的磷酸盐生成多聚磷酸盐 的催化剂。杜宏伟等 的研究表明，表达磷酸激酶的假单胞 菌可去除模拟污水中９ｏ％以上的磷酸盐，是对照菌株的１５倍； Ｍｉｃｍｂｉｏｌ Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌ，２００６，７２：７７７—７８２． ［１０］ＢＩＺＩＬＹ Ｓ Ｐ，ＰＵＧＨ Ｃ Ｌ，ＳＵＭＭＥＲＳ Ａ Ｏ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈ— ｙｌｍｅｒｃｕｒｙ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ：ｍｅｒＢ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｏｕｆｅＹｓ ｒｅｓｉｓｔ ａｎｔｅ ｔｏ ｏｒｇａｎｏｍｅｒｃｕｒｉｌａｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９，％：６８０８— ６８１３． 王勤等 的研究表明，转化ＰＰＫ基因的大肠杆菌细胞内聚磷 含量比对照菌株高了２０倍；任晶等 的研究表明，转化ＰＰＫ 的大肠杆菌，对浓度高达３５ ｍｇ／Ｌ的磷酸盐溶液在６５ ｈ内的 ［１１］ＢＩＺＩＬＹ Ｓ Ｐ，ＰＵＧＨ Ｃ Ｌ，ＭＥＡＧＨＥＲ Ｒ Ｂ．Ｐｈｙｔｏｄｅｔｏｘｉｉｆｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｚａｒｄ— ＯＵＳ ｏｒｇａｎｏｍｅｒｃｕｒｉａｌｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｅｈｎ－ ｏ１．２０００．１８：２１３—２１７． 去除效果达９９％以上，并以聚磷的形式积累在细胞内。因此， 通过转基因技术将ＰＰ 基因导入植物，以期转基因植物具有 高效聚磷能力的研究具有重要意义。 ［１２］韩小艳，赵娜，王永祥．接头序列及其在融合蛋白掏建中的应用［Ｊ］． 河北医科大学学报，２Ｏ０７，２８（３）：２２４—２２７． ［１３］杜宏伟，武俊，肖琳，等．聚磷激酶基因在假单胞菌中的整合和表达 ［Ｊ］．环境科学，２ＯＯ９，３０（１０）：３０１１—３０１５． ［１４］任晶，肖琳，郑／＿、红，等．转聚 晦大肠杆菌诱导表达条件及磷浓度 对其除磷能力的影响［Ｊ］．环境保护科学，２００８，３４（６）：１—４． （上接第１５１３５页） 中国．，２００７１００１９６３５．６ｌＰｊ．２００７—０８—０１． 解决的即农作物耐盐性、秸秆高效利用的关键科技问题。作 物远缘品种有利基因的挖掘与创新是目前作物品种改良的 一个重要途径。利用米草耐盐、水稻高产、甜高粱甜秆基因 进行远缘杂交，选育出耐盐、甜秆的优质粮饲兼用水稻新品 种，不但可解决沿海开发、盐碱地治理中急需解决的耐盐作 物品种问题，而且可解决草食动物精粗饲料问题，同时由于 稻草秸秆含糖量增加，草食动物可高效利用秸秆，还能解决 秸秆焚烧所带来的环境污染问题。因此该研究对于资源利 用、农业增效、粮食安全、耕地战略等方面有着重要的科学意 义，具有广阔的应用前景。 参考文献 ［１］陈启康，沙文锋，戴晖，等．海涂大米草与水稻属间远缘杂交育种方法： ［２］陈启康，沙文锋，顾拥建，等．海涂米草与水稻远缘杂交种质资源发掘 与创新［Ｊ］．西南农业学报，２００９，２（４）：８７７—８８３． ［３］刘正理，程汝宏，黄文胜，等．甜秆多穗型超早熟谷子新种质的创新 ［Ｊ］．中国农业 ，２００５，３８（１）：ｌ７—２１． ［４］祁适雨，辛文利，马有志，等．优质食、饲两用甜秆小麦——龙１８５８８ ［Ｊ］．麦类作物学报，２００４，２４（３）：１３８． ［５］丘杰，杨必建，江良荣，等．水稻与高梁属间远缘杂交花粉管行为观察 ［Ｊ］．分子植物育种，２００５，３（６）：８３５—８４０． 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