细胞污染的检测与去除

第四节 细胞污染的检测与去除

细胞培养最怕的就是细胞污染。一旦细胞发生污染，轻的，导致实验无法正常进行，严重的，可能会导致细胞株的丢失。细胞污染：是指细胞培养物中混入培养环境中的对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。 细胞污染的主要途径有：

1）空气因素：空气是微生物传播的最主要途径。在超净工作台、细胞培养室工作时，不戴口罩，不带头套，面对操作间大声讲话、咳嗽等均可能造成细胞污染。

2）器材因素：主要是细胞培养用器材清洗消毒不彻底，致使污染物残留；培养箱没有定期消毒，易使细菌、霉菌孽生，形成污染。

3）操作因素：实验操作者无菌观念不强、操作不规范、甚至使用污染的器具等。培养两种以上细胞时，交叉使用吸管或培养液瓶等导致细胞交叉污染。

4）血清或培养基：有些血清生产时已被支原体或病毒等污染，有的在培养基配制过程中已经污染，或者在培养基的存放过程中导致了污染。

5）组织样本：尤其在进行原代培养时，组织样本可能带菌，导致污染。 细胞污染的主要类型有（图1）：

图1 细胞污染的主要类型

第一，细菌污染：细菌是细胞培养中最常见的污染。细菌种类繁多，形态多样，可呈球状、杆状和螺旋状。因为细菌的繁殖速度快，被污染后，往往一天内即可通过肉眼观察发现，pH值也会突然降低，培养基的颜色也会很快变化，培养液会变浑浊。

轻微细菌污染的去除: 可使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击法，加抗生素作用24-28 h，再换成常规培养液，有时可排除污染，但大部分细胞培养的细菌污染发现时就已经很严重了，无法挽救，最好直接丢弃，防止污染的扩大。 细胞培养细菌污染的主要检测方法有：肉眼观察法；培养检查法；显微镜观察法；PCR检测法等。

1）肉眼观察法：（图2），如图，这是正常生长细胞在不同时间的培养基的颜色，污染细胞培养基会变得浑浊，培养基会快速变黄（因大量细菌繁殖会导致pH 快速下降）。

刚传代细细胞培养中需要传代的细

图2󰀢正常生长细胞培养基的颜

2）培养检查法：就是用细胞培养上清在无菌琼脂糖培养基平板上划线培养，37℃培养箱中培养过夜，看是否有细菌菌落长出（图3）。这就是细菌在平板上长出的菌落。

图3 细菌菌落

3）显微镜观察法：就是将细胞培养瓶放置在倒置显微镜下观察，查看是否有污染细菌出现，这两个图就是细胞被细菌污染后的显微图片（图4）。

图4 细菌污染的细胞

4）PCR检测：可以把细胞培养上清拿来针对原核细胞16S RNA做PCR检测。（图5）图中可看出，PCR结果中有16S RNA的特征条带说明有细菌污染。

图5 针对原核细胞16S RNA做PCR检测

第二，真菌污染，培养细胞中，常见的真菌污染有：烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。

1）霉菌污染是常见的真菌污染：霉菌污染一般显微镜下甚至肉眼可见，容易发现，短期内培养基多不浑浊，但有白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见在细胞之间有纵横变错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，严重的甚至能看到霉菌孢子（图6），图中就是细胞严重霉菌污染的情况。

图6 细胞的霉菌污染

霉菌污染的去除：可考虑用制霉菌素25 μg/mL或酮康唑10 μg/ mL对细胞进行处理去除霉菌。

2）酵母菌污染：酵母菌污染后pH值变化很小，在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会有出芽。下图是细胞轻微酵母菌污染的情况（图7）。

图7 细胞的酵母菌污染

第三，支原体污染：支原体污染的细胞，外观没有明显的变化，但是，支原体污染会改变培养体系中细胞的行为和代谢，造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变，也会导致形态改变(图8)。

图8 细胞的支原体污染

支原体污染不容易被发现，但当你的细胞生长缓慢时，要查看是否有支原体污染。 检测支原体污染的主要方法有：荧光染色、ELISA、PCR、免疫染色、电子显微镜观察等。

荧光染色法是支原体检测是常用方法。常用Hoechst 33258（浓度为50 μL/mL）对培养的细胞进行染色。在荧光显微镜下观察，支原体内的DNA会着色。

(图9)图中，细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点就是支原体。

无支原体󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢支原体轻度污染󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢󰀢支原体严重污染󰀢

图9 支原体污染的的荧光检测

支原体的清除方法主要有：1）抗生素处理法:就是用四环素类、大环内酯类以及氟喹诺酮、M-Plasmocin等抗生素处理细胞，杀灭支原体，而且不影响细胞本身的代谢。2）高热处理法：将受支原体污染的细胞在41℃作用5-10 小时，最长可达18小时，可以杀死支原体；3）小鼠传代处理：这个主要针对肿瘤细胞，就是污染的肿瘤细胞株接种于BALB/c裸鼠的颈背部皮下，在动物体内，因为有巨噬细胞和淋巴细胞会清除支原体，肿瘤细胞很快生长成瘤，再把这个肿瘤剥离，进行原代培养又可获得肿瘤细胞株。

第四，细胞交叉污染：细胞交叉污染是一个非常严重的问题。会导致你的细胞不纯，甚至丢失，因为，如果污染的细胞生长速度快，通过多次传代会成为优势细胞。

细胞交叉污染的预防主要包括：

1）实验器材如吸管不能混用，几种细胞同时实验时，器材要提前做好专用标记。 2）细胞培养液公用时，细胞吸管和细胞用液要严格分开，防止操作失误导致细胞交叉污染。千万不能用细胞吸管吸取细胞后再吸取培养基或缓冲液。造成培养基或缓冲液中污染有细胞。

3）所有细胞株都要在早期保留充足的冻存样本，以防细胞丢失。 4）尽量从声誉可靠的细胞库获取细胞系、并定期检查细胞系的性质。

细胞污染是细胞培养的死敌，我们在细胞培养过程中，不仅要养成严谨的习

惯，杜绝由于操作失误造成的污染，还要经常对细胞进行检测，防止支原体污染、细胞间的交叉污染等这些不易发现的污染风险。