假交替单胞菌遗传操作系统的研究进展

第４６卷第２期　２０１７年５月　发酵科　技通讯　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ＿４６　ＮＯ．２　Ｍａｙ　２Ｏｌ７　假交替单胞菌遗传操作系统的研究进展　羊燕燕，裘娟萍，余志良　（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州３１００１４）　摘要：假交替单胞菌能产生多种胞外活性物质，赋予其重要的基础研究和应用研究价值．目前已有　多株假交替单胞菌完成基因组测序．基因组序列分析揭示不同的假交替单胞菌具有产生不同活性　代谢产物的能力．假交替单胞茵遗传操作体系欠成熟，这极大地限制了假交替单胞茵的研究与应　用．主要对近十多年来假交替单胞菌遗传操作系统研究进展进行综述，包括感受态制备，穿梭载体、　自杀敲除载体及筛选标记的成功应用，以期为假交替单胞菌遗传操作系统的发展提供参考．　关键词：假交替单胞菌；遗传操作；接合转移　中图分类号：Ｑ９３３　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７４—２２１４（２０１７）０２－０１００—０７　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ＹＡＮＧ　Ｙａｎｙａｎ，ＱＩＵ　Ｊ　ｕａｎｐｉｎｇ，ＹＵ　Ｚｈｉｌｉａｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉ。ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｗａｓ　ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｉｎ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．　Ｓｏ　ｆａｒ，ｓｅｖｅｒａｌ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｔＯ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．　Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｌａｃｋ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｇｒｅａｔｌｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｅｖｅ［．Ｈｅｒｅ，ｗｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ，ｓｕｉｃｉｄｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍａｒｋｅｒｓ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ；ｃｏｎｊ　ｕｇａｔｉｏｎ　假交替单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）在分类学　上属于细菌域、变形菌门、７一变形菌纲、交替单胞菌　面具有广阔的应用前景．　生物体内代谢途径控制着细胞活性物质的产　生，了解和掌握活性物质的代谢途径及调控机理对　活性物质的工业化生产十分重要．因此，构建一套适　用于假交替单胞菌的遗传操作系统（利用基因工程、　目、交替单胞菌科、假交替单胞属口］，是一类好氧异　养型、不产芽胞、具有鞭毛的革兰氏阴性细菌，能产　胞外多糖＿２］、色素　］、抗菌溶菌物质　和胞外酶（如　淀粉酶ｌ５］、琼胶酶［６　）等多种活性物质，这些活性物　蛋白质工程等技术［１　］）是开发利用假交替单胞菌活　性物质极为重要的基础工作．目前，部分假交替单胞　菌全基因组序列已测定，这为遗传操作体系的构建　奠定了基础，但丰富的耐多药抗性基因、药物流出泵　质有抗菌溶菌、裂解藻类和降解琼脂等多种生物学　功能，在养殖业的生物防治＿７］、赤潮治理ｌｌ８Ｊ，在抗菌　抗肿瘤新型海洋药物的开发　收稿日期：２０１７－０３—２３　及工业生产口　等方　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１６７０１１４）；浙江省自然科学基金资助项目（ＬＹ１６ｃＯ１ＯＯＯ２）；国家海洋经济创新发展区域示范项目　（１２ＰＹＹＯＯ１ＳＦ０８）　作者简介：羊燕燕（１９９２一），女，浙江磐安人，硕士研究生，研究方向为应用微生物学，Ｅ—ｍａｉｌ：２１１１４０５１０９＠ｚｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．通信作者：余志　良副教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｌｙｕ＠ｚｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．　第２期　羊燕燕，等：假交替单胞菌遗传操作系统的研究进展　及遗传修饰体系的存在导致假交替单胞菌遗传操作　还不是很成功口　，这限制了在分子水平对该类细菌　的改造，从而影响了对假交替单胞菌产生活性物质　的机制及调控机理的深入研究．遗传操作是指在体　外将目的ＤＮＡ片段连接到载体上，形成重组　ＤＮＡ，并将其转入宿主细胞进行表达或沉默宿主特　定基因的过程，涉及到的操作主要有感受态制备、载　体构建、转化方法和筛选标记的选择等．经过十多年　研究，假交替单胞菌遗传操作系统研究已有一定进　展，笔者主要从感受态制备、转化方法、载体构建和　筛选标记的选择等方面对其遗传操作体系的研究进　展进行概述．　感受态细胞的制备　细胞感受态是指细菌具遗传转化的能力，即通　过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外　来ＤＮＡ的生理状态．目前鲜有假交替单胞菌感受　态制备的相关研究报道．Ｋｕｒｕｓｕ等［１　将培养至对　数生长期的Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＳＩＭ３离心取　菌体，用１Ｏ　ｍＬ含７　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ一（２一羟乙基）哌嗪一Ｎ一　（２－乙磺酸）和２５２　ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖（ｐＨ　７．ｏ）的缓冲液　洗涤、重悬菌体两次，最后将菌体用同种缓冲液悬浮　成１００　Ｌ体积的感受态细胞．Ｚｈａｏ等ｎ　将培养至　对数生长期的细胞离心取菌体，用预冷的ｄｄＨ　Ｏ洗　涤、重悬菌体两次，最后用１００　Ｌ含２０　ｍｍｏｌ／Ｌ葡　萄糖的ｄｄＨ２Ｏ重悬，成功制备Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｂｓｉ２０４２９感受态细胞．此外，笔者借鉴普通大肠　杆菌和枯草芽孢杆菌感受态制备条件，在感受态制　备过程中使用高渗溶液作为电击缓冲液以保护嗜盐　的假交替单胞菌．取Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｒ３对　数生长期细胞，用１０　ｍＬ含０．５　ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、　０．５　ｍｏｌ／Ｌ的甘露醇和体积分数为１０％的甘油的预　冷缓冲液Ａ洗涤、重悬Ｒ３菌体两次，用１Ｏ　ｍＬ含　０．５　ｍｏｌ／Ｌ海藻糖、０．５　ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、０．５　ｍｏｌ／Ｌ　的甘露醇和体积分数为１Ｏ　的甘油的缓冲液Ｂ洗　涤一次，最后用１００肛Ｌ缓冲液Ｂ重悬，制备Ｒ３感　受态细胞．加复苏培养基复苏２　ｈ后，涂布平板培　养，结果平板上有３０５个菌落生长，说明该方法可以　用于制备Ｒ３感受态细胞．　２假交替单胞菌遗传操作载体　２．１穿梭载体　穿梭载体是将两个亲缘关系不同的复制子整合　在一个质粒上，以期能在两个不同的菌种中实现复　制和异源表达．目前，与假交替单胞菌有关的穿梭载　体都是大肠杆菌一假交替单胞菌系列，包括ＣｌｏｎｅＱ，　ｐＰＡＣＥ１，ｐＷＤ和ｐＯｒｉＴ一４Ｅｒａ．　２．１．１　质粒ＣｌｏｎｅＱ　２００１年，Ｔｕｔｉｎｏ等ｌ＿１　在游海假交替单胞菌　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ　１２５中发现　内源质粒ｐＭｔＢＬ，大小为４　０８１　ｂｐ．将其最小复制　单元片段ＡＲＳ克隆至大肠杆菌表达载体ｐＧＥＭ—Ｔ　上，构建了４．７　ｋｂ的大肠杆菌～假交替单胞菌穿梭　载体ＣｌｏｎｅＱ，并利用该穿梭载体在嗜冷假交替单胞　菌中异源表达了ａ一淀粉酶基因．　２．１．２质粒ｐＰＡＣＥ１　２００１年，Ｋｕｒｕｓｕ等ｕ　在Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＳ１Ｍ３中获得了大小为３．１　ｋｂ的内源质粒　ｐＰＳＩＭ３．在该质粒上插入大肠杆菌ｐＨＳＧ９９载体　的复制起始（ｏｒｉ）和氯霉素、红霉素抗性基因，获得　了大小为７．０　ｋｂ的大肠杆菌一假交替单胞菌穿梭载　体ｐＰＡＣＥ１．研究者将该穿梭载体成功导入到消除　了内源质粒的Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＳＩＭ１３菌　中，实现了氯霉素、红霉素双抗重组菌的稳定　传代　］．　２．１．３质粒ｐＷＤ系列　Ｚｈａｏ等口　］从Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｂｓｉ２０４２９　中获得内源性质粒ｐＳＭ４２９，测序发现该质粒包含４　个开放阅读框．将４个开放阅读框随机组合克隆至　ｐＵＣ１９质粒，同时加入大肠杆菌ｐＢＲ３２２质粒复制　起始（ｐＢＲ３２２　ｏｒｉｇｉｎ）和氯霉素抗性标记，构建了含　有不同开放阅读框的系列大肠杆菌一假交替单胞菌　穿梭载体（ｐＷＤ１～ｐＷＤ６）．将不同穿梭载体电转化　至已消除内源性质粒的Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｂｓｉ２０４２９中，结果发现４号开放阅读框是ｐＳＭ４２９　质粒的最小复制单元，而１号和２号开放阅读框在　ｐＳＭ４２９质粒稳定中起重要作用．随后，研究者利用　构建的穿梭载体ｐＷＤ２，在Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｂｓｉ２０４２９中成功表达了红霉素抗性基因和纤维素　降解酶基因．Ｗａｎｇ等［１３］发现将ｐＷＤ２穿梭载体导　人到９株不同假交替单胞菌中的转化效率为　ｌ０一　～ｌ０一。．　２．１．４　ｐＯｒｉＴ一４Ｅｍ　Ｙｕ等［１　将接合转移起始ｏｒｉＴ、质粒ｐＵＺ８００２　在Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ中复制的元件ｐｈａｇｅ　ｆｌ及　ｐＳＭ４２９质粒上的ｒｅｐＡ复制起始连接到ｐＷＤ２，构　建了大小为６　７０２　ｂｐ的大肠杆菌～假交替单胞菌穿　梭载体ｐＯｒｉＴ一４Ｅｍ，研究者将其导人Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏ—　发酵科技通讯　第４６卷　ｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＳＭ９９１３，转化效率为１．８×１０．　２．２自杀性敲除质粒　因上下游具有一定同源性的融合片段；５）用于可诱　导供体菌和受体菌接合转移的转移酶基因ｔｒａ和接　合转移起始ｏｒｉＴ＿＿】　¨］．目前报道的关于假交替单胞　菌基因敲除的自杀质粒均包括以上５个元件．自杀　敲除载体的图谱归纳见图１，两轮同源重组敲除示　意图归纳见图２．　自杀质粒的性质是复制时需要一种特殊蛋白，　即协助复制起始的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋　白质，因此当自杀质粒进入受体细胞时，不能以游离　的方式复制，只能整合到受体细胞染色体上随着宿　主染色体的复制而复制，自杀质粒的这个特点常用　于基因的敲除．　将构建的基因缺失片断克隆至自杀质粒，在抗　性选择压力下，利用缺失基因两端的同源片断，自杀　始　质粒被迫整合到基因组上发生第１轮单交换．再在　第２轮反筛选压力下得到发生第２轮单交换的敲除　子．因此自杀性敲除质粒一般包括５个元件：１）能　启动在供体菌复制而不能启动在受体菌复制的复制　起始口　；２）用于第１轮正向筛选的抗性标记；３）　用于第２轮反筛选的标记；４）与染色体上欲敲除基　发生在５　端：　自杀复　接合转　制起始移起始　反向筛　选标记　上游同源臂　（ｕｐ）下游同源臂　（ｄｏｗｎ）　图１　自杀敲除载体示意图　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｓｕｉｃｉｄｅ　ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｖｅｃｔｏｒ　正向筛　选标记　１　发生　Ｅ３　端：　ｒ　ｄｏｗｎ　Ｈ　Ｈ卜＿Ｌ　Ｈ—Ｈ　ｕｐ　反向筛　选标记　目的基因　ｄｏｗｎ　自杀复　接合转　制起始移起始　—　正向筛　选标记　ｕｐ　ｌ　目的基因Ｊ　ｄｏｗｎ卜Ｌ　Ｈ　Ｈ　Ｈ　Ｈ　ｕｐ　Ｉ　ｄｏｗｎ卜　（ａ）第一轮单交换　ｕｐ　ｌ目的基因ｌ　ｄｏｗｎ　（ｂ）第二轮单交换　图２两轮同源重组敲除示意图　”　Ｆｉｇ．２　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｒｏｕｎｄｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｅｖｅｎｔ　２．２．１　质粒ｐＶＳ　、　２．２．２质粒ｐＭＴ　Ｐａｒｒｉｌｌ等ｍ　将广泛宿主克隆载体ｐＪＢ３　Ｅ　上　ｏｒｉＴ位点克隆至表达载体ｐＧＥＭ一７ｚ，构建　ｐＧＥＭ７Ｚ—ｏｒｉＴ质粒；再以克隆载体ｐＫＳＳｌ２　为模板　获得ｐｈｅＳ　ｙ２　反筛选标志，克隆至ｐＰＭ１３质粒＿２　，　获得ｐＰＭ１３－ｐｈｅＳ　质粒，并以此质粒为模板克　基因至ｐＧＥＭ７Ｚ－　隆Ｐ１３嗜冷启动子及ｐｈｅＳ　Ｙｕ等口　酶切假交替单胞菌一大肠杆菌的穿梭　载体ｐＯｒｉＴ一４Ｅｒａ，将ｒｅｐＡ片段移除，加入Ｅｒｙ抗性　基因和ｓａｃＢ反筛选标记，构建了自杀穿梭敲除载体　ｐＭＴ，将其导人Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＳＭ９９１３　中，敲除了菌株ＳＭ９９１３中编码糖基转移酶基因　ｅｐｓＴ和与鞭毛运动性有关调控蛋白基因及２个极　生鞭毛蛋白丝基因．　２．２．３　质粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－Ｅｒｙ和ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－　Ｃｍ　ｏｒｉＴ质粒，最终构建了自杀载体ｐＶＳ．Ｐａｒｒｉｌｌｉ　等　删利用这个自杀质粒，通过Ｊ３一内酰胺酶（ｂｅｔａ—　ｌａｃｔａｍａｓｅ，ｂｌａＭ）和ｐｈｅＳ　蚰　基因作为正负筛选标　记，构建了假交替单胞菌ＴＡＣ１２５的蛋白酶分泌途　径中ｇｓｐＥ基因缺失的突变株（Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５：：ＶＳｇｓｐＥ），导致突变株ＴＡＣ１２５胞外蛋　Ｗａｎｇ等口　将红霉素Ｅｒｙ基因和氯霉素Ｃｍ基　因克隆到自杀质粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿２。　中，构建了　ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－Ｅｒｙ和ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－Ｃｍ敲除质粒，　白酶活性降低，从而避免表达的外源重组蛋白被　降解．　成功敲除了Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｒｕｂｒａ　ＤＳＭ６８４２中　灵菌红素生物合成基因ｐｉｇＭ－Ｋ，Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏ—　第２期　羊燕燕，等：假交替单胞菌遗传操作系统的研究进展　ｍｏｎｓｓ　ｓｐ．ＳＭ９９１３中编码生物膜和运动性基因　ｂｓｍＡ，Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ　ＳＣＳ１００４３０　１　中编码尿黑酸１，２－双脱氧酶基因ｈｍｇＡ和Ｐｓｅｕｄ—　ｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＳＣＳ１０ｌ１９００中编码鞭毛马达蛋　白基因ｆｌｉＦＧ＿１３］．此外，ｐＡＫ４０５［　］和ｐＣＶＤ４４２　。。　也常用于革兰氏阴性菌的基因敲除，但至今还没有　用于假交替单胞菌的成功报道．综上，已成功运用的　穿梭载体都是将特定的假交替单胞菌的复制元件与　大肠杆菌的复制起始克隆入载体，因此是特定假交　替单胞菌专用的穿梭载体．而自杀敲除载体是假交　替单胞菌及其他种属通用的敲除载体．　３重组ＤＮＡ转化方法　有效的转化方法是实现外源ＤＮＡ导入受体细　胞的基础＿＿３　．细菌常用的转化方法有：自然转化、电　转化、热激转化和种间接合转移等．目前成功应用于　假交替单胞菌遗传操作的转化方法主要有电转化和　接合转移，特别是接合转移成功案例更多．因此接合　转移是假交替单胞菌通用的转化方法，而电转化方　法比较局限，可能是部分假交替单胞菌专用．　３．１接合转移及成功案例　接合转移是指两细菌细胞直接接触，供体细胞　中的Ｆ质粒将其携带的遗传信息转移到受体细胞　的过程．Ｆ质粒通过接合转移进入受体菌依赖于接　合转移起始ｏｒｉＴ和转移区ｔｒａ＿３　，ｔｒａ区编码一个　ＤＮＡ松弛酶，识别、结合到ｏｒｉＴ位点，切开质粒的　一条链，并共价结合到转移链的５　端形成单链　ＤＮＡ，游离的单链ＤＮＡ通过细胞膜ＩＶ型分泌系统　（Ｔｙｐｅ　４　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ４ＳＳ）进入宿主菌后形　成双链ＤＮＡ并在宿主中稳定传代．由于转移的片　段是单链ＤＮＡ，故可以减少受体菌限制修饰系统对　它的降解，提高转化效率口　．　Ｔｕｔｉｎｏ等Ｅ１６］在２００１年将外源敲除质粒通过接　合转移的方式导入Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５，成功　构建胞外蛋白酶活性降低的Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５突变株．２００４年，Ｄｕｉｌｉｏ等　。“通过接合转　移将带有Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　Ａ２３的ｄ一淀粉酶的重组　质粒在Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ中实现了重组蛋白的异源　表达．Ｅｇａｎ等　。胡通过接合转移将Ｍｉｎｉ—Ｔｎｌ０转座　子随机插入假交替单胞菌基因组中，成功构建色素　和抗真菌物质突变体库．此外，２０１０年本实验室在　产Ｌ一氨基酸氧化酶的调控机理研究中也通过接合　转移成功将Ｍｉｎｉ—Ｔｎｌ０转座子随机插入Ｐｓｅｕｄ—　ｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｒｆ－１基因组上＿３　．　３．２　电转化及成功案例　相对于接合转移，假交替单胞菌电转化方法研　究较少．电转化是利用脉冲电场提高细胞膜的通透　性，使细胞膜上形成纳米孔大小的微孔，将ＤＮＡ转　移到受体细胞中　．２００１年，Ｋｕｒｕｓｕ等＿１　首次将　电转化应用于假交替单胞菌中，７　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ一（２－羟　乙基）哌嗪一Ｎ一（２一乙磺酸）和２５２　ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖组成　ｐＨ　７．０的电击缓冲液，在电压２　０００　Ｖ／ｃｍ、电阻　２００　Ｑ、电容量５０　Ｆ的电击条件下，成功将他们自　己构建的穿梭载体ｐＰＡＣＥ１导入消除了内源性质　粒的Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＳ１Ｍ１３中，实现了重　组菌的稳定传代．２０１１年，Ｚｈａｏ等＿１　５＿以含有　２０　ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖双蒸水溶液为电击缓冲液，成功　将质粒ｐＷＤ２电击导入已消除内源性质粒的　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｂｓｉ２０４２９中，并成功表达了　质粒携带的红霉素抗性基因和纤维素降解酶基　因＿１　．此后，Ｗａｎｇ等　利用载体ｐＷＤ２，尝试通过　电转化的方法在其他假交替单胞菌中进行基因敲　除，但因转化效率太低，基因敲除并未成功．　４转化子选择标记　合适有效的筛选标记有助于快速获得目的转化　子．已报道可用于假交替单胞菌遗传操作的筛选有　正向筛选（抗性筛选）和两轮同源重组敲除的反向　筛选．　４．１　正向筛选　抗生素抗性标记是常用的转化子筛选方法．筛　选原理是在抗生素平板上只有发生转化而获得外源　抗性基因的转化子才能在该种抗生素选择压力下生　长，未发生转化的细胞不能生长．　４．１．１　青霉素类抗性标记　Ｐａｒｒｉｌｌｉ等＿２。　等在研究构建Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡｃ１２５突变株工作中将羧苄青霉素（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌ—　ｌｉｎ，Ｃａｒ）、氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，Ａｍｐ）作为抗性筛　选标记，在３０／￣ｇ／ｍＬ　Ｃａｒ和１００　ｕｇ／ｍＬ　Ａｍｐ抗性　平板上实现了Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５重组子的　筛选．　４．１．２氯霉素、红霉素抗性标记　２０１５年，Ｗａｎｇ等　。］对９株假交替单胞菌进行　抗生素抗性研究，发现９株亲株对２５　ｕｇ／ｍＩ　红霉　素（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，Ｅｒｙ）和３０／，ｇ／ｍＬ氯霉素（ｃｈｌｏｒ—　ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，Ｃｍ）均敏感，在基因敲除研究中以Ｅｒｙ　为标记获得转化子Ｐ．ｒｕｂｒａ　ＤＳＭ　６８４２，Ｐ．１ｉｐｏ—　ｌｙｔｉｃａ　ＳＣＳＩＯ　０４３０１．以Ｃｍ为标记获得转化子Ｐ．　・１０４・　发酵科技通讯　第４６卷　ｓｐ．ＳＭ　９９１３，Ｐ．ｓｐ．ＳＣＳ１０　１１９００．　４．１．３　正向筛选的缺点　由于假交替单胞菌存在丰富的耐多药抗性基因　和药物流出泵，抗生素抗性筛选在假交替单胞菌中　易失效［１　．因此，选择合适的抗性筛选标记非常　重要．　４．２反向筛选　反向筛选一般适用于两轮同源重组的遗传操作　体系的第２轮筛选．反筛选标记是指在第１轮正向　筛选的基础上增加１轮筛选压力，第１轮转化子在　相应反筛选物质的平板上不能生长，只有发生第２　轮基因重组，将反筛选标记丢失的转化子才能生长．　常见的反筛选标记有：ｓａｃＢ基因（编码果聚糖蔗糖　酶）［１。删和ｐｈｅＳ　基因（编码苯丙氨酸一ｔＲＮＡ合　酶基因的突变体）［２７，３７］．反筛选图示归纳见图３．　正　正　涂布　正向筛选平板（添加　反向筛选平板（添　正向筛选的抗生素）　加氯苯丙氨西　／蔗糖）　图３反筛选图示　Ｆｉｇ．３　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｏｆ　ｃｏｕｎｔｅｒ　ｓｅｌｅｃｔ　４．２．１　ｓａｃＢ反筛选标记　ｓａｃＢ反筛选的原理：ｓａｃＢ编码蔗糖果聚糖酶，　具有蔗糖水解酶和果糖转移酶双重活性，蔗糖水解　酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，果糖转移酶催化果　糖合成果聚糖　，果聚糖对革兰氏阴性菌具毒害作　用，毒害机制还不清楚　．当培养基中含有质量分　数１Ｏ　的蔗糖时，蔗糖果聚糖酶催化蔗糖水解并最　终合成果聚糖，导致菌体死亡，故带有ｓａｃＢ基因的　第１轮转化子在质量分数１Ｏ　蔗糖平板上不生长　而发生第２轮重组后将ｓａｃＢ基因丢失的转化子能　生长．　４．２．２　ｐｈｅＳ　ｙ２　反筛选标记　ｐｈｅＳ　反筛选的原理：当ｐｈｅＳ编码的Ｐｈｅ—　ｔＲＮＡ合酶的第２９４位氨基酸突变成甘氨酸后，　Ｐｈｅ—ｔＲＮＡ合酶的ａ亚基发生突变，突变后的酶对　底物特异性会降低，使得有毒的苯丙氨酸类似物氯　苯丙氨酸（ｐＣ１一Ｐｈｅ）也能被利用，从而致死宿主　菌　－４０＿．因此往培养基中添加氯苯丙氨酸，带有　ｐｈｅＳ　基因第１轮转化子不生长，只有发生第２　轮重组将ｐｈｅＳ　基因丢失的转化子能生长．　４．２．３反向筛选的缺点　后续研究发现ｓａｃＢ和ｐｈｅＳ　作为反筛选标　记存在缺点［２　．ｓａｃＢ反筛选的缺点是会发生高频率　的对果聚糖有抗性的自发突变事件，使得第１轮重　组子也能在质量分数ｌ０　的蔗糖平板上生长；而　ｐｈｅＳｄ　反筛选的缺点是培养基中ｐＣ１一Ｐｈｅ的添加　对受体细胞具损伤作用．　５　结　论　近１５年来，随着假交替单胞菌内源性质粒的发　现、最小复制单元的分离和测序，假交替单胞菌遗传　操作体系的研究已取得较大进展，包括电转化感受　态的制备，穿梭质粒、敲除质粒和筛选标记的成功应　用．但假交替单胞菌遗传操作体系还存在可以改进　或完善的地方，比如，自杀敲除载体复制起始位点可　能不够严谨；两轮同源重组敲除的反筛选标记有局　限性，它们或在第２轮反筛选添加浓度下，第１轮突　变子依旧生长，或在低于第２轮反筛选１０倍添加浓　度下依然能致死宿主菌．近来，Ｊｕｌｉａ等Ｌ２妇为了避免　鞘酯单胞菌中ｓａｃＢ，ｐｈｅＳ　嵋　两个反筛选标记存在　的缺陷，使用了ｒｐｓＬ（链霉素反筛选标记）作为反筛　选标记，成功实现了鞘酯单胞菌Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｆｒｌ中编码响应调节子基因ｐｈｙＲ、选择性口因子　ｏ　、番茄红素环化酶基因ｃｒｔＹ和八氢番茄红素脱　氢酶基因ｃｒｔＩ的敲除．这个反筛选标记有望在假交　替单胞菌中应用．另外，转化方式的局限极大地限制　了假交替单胞菌遗传操作体系的应用，摸索行之有　效的转化体系极为迫切．近年来兴起的以ＲＮＡ为　向导的Ｃａｓ９Ｉ４１］的敲除手段也有望运用于假交替单　胞菌．随着分子生物学和基因工程技术的进步，通过　针对性的基因修改，探究假交替单胞菌活性代谢产　物的代谢途径和调控机理，将为假交替单胞菌来源　的活性产物实现工业化生产提供理论基础＿４　．　参考文献：　［１］于子超．海洋假交替单胞菌适应海冰环境的机制及其遗传操　作体系的建立［Ｄ］．山东：山东大学，２０１４．　［２３　ＧＥＥＳＥＹ　Ｇ　Ｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｅｘｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｅｃｏｎｏｍ—　第２期　羊燕燕，等：假交替单胞菌遗传操作系统的研究进展　ｉｃ　ｃ０ｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｓｍ　ｎｅｗｓ，１９８２，４８：９－１４．　［３］ＨＯＩ　ＭＳＴＲＯＭ　Ｃ，ＫＪＥＬｌ　ＥＢＥＲＧ　Ｓ．Ｍａｒｉｎｅ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏ一　￣ｏｎａｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｐｒｏ～　ｄｕｃｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳ　ｍｉｃｒｏ～　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｃｏｌｏｇｙ，】９９９，３０（４）：２８５—２９３．　［４］　ＧＡＵＴＨＩＥＲ　Ｍ　Ｊ．Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｒｕｂｒａ　ｓｐ．ｎｏｖ．ａ　ｎｅｗ　ｍａｒｉｎｅ　ａｎｔ．ｈｉｏｔｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９７６，２６（４）：４５９—４６６．　［５３　席宇，朱大恒，刘红涛，等．假交替单胞菌及其胞外生物活性物　质研究进展ＥＪ］．微生物学通报，２００５，３２（３）：１０８一ｌ１２．　［６］　ＤｏＢＲＥＴＳ０Ｖ　Ｓ。ＱＩＡＮ　Ｐ　Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ａｌｇａ　ｕｌｖａ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ　ｏｎ　ｍａｒｉｎｅ　ｍｉｃｒｏ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏ—　ｆｏｕｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ，２００２，１８（３）：２１７－２２８．　［７］　ＹＵ　Ｍ，ＴＡＮＧ　Ｋ，ＬＩＵ　Ｊ，ｅｔ　ａ【．Ｇｅｎｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄ—　ｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｆＺａｖｉｐｕｌｃｈｒａ　ＪＧ１　ｒｅｖｅａｌｓ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｄｖａｎ—　ｔａｇｅｓ　ｉｎ　ｍａｒｉｎｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［ｊ］．ＢＭＣ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３，１４　（１）：７０７－７１８．　［８３　Ｌ０ＮＧ　Ｒ　Ａ，ＱＵＲＥＳＨＩ　Ａ，ＦＡＵＬＫＮＥＲ　Ｄ　Ｊ，ｅｔ　ａＩ．２－ｎ—Ｐｅｎ－　ｔｙｌ－４一ｑｕｉｎｏｌｉｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍａｒｉｎｅ　Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｏｌｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１）：５６８—５７６．　［９］　ＥＧＡＮ　Ｓ，ＨＯＬＭＳＴＲＯＭ　Ｃ，ＫＪＥＬＬＥＢＥＲＧ　Ｓ．ＰｓＰ“ｄ０口ＩｔＰｒ—　ｏｍｏｎａｓ　ｕｌｖａｅ　ｓｐ．ｎｏｖ．ａ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｆｏｕｌｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉ—　ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ａ　ｍａｒｉｎｅ　ａｌｇａ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ＆ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００　１，５　１　（４）：１４９９－１５０４．　［１Ｏ］　ＡＵＳＴＩＮ　Ｂ．Ｎｏｖｅｌ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８９，６７（５）：　４６１—４７０．　［１１］　孙星．养殖文蛤溶藻弧菌、颉颃菌的筛选与鉴定及其颉颃物　质的研究［Ｄ］．南京：南京农业大学，２Ｏ１２．　［１２］　汪钊，黄美娟，高亮，等．化学酶法合成Ｉ）．泛解酸内酯的研　究进展ＥＪ］．发酵科技通讯，２０１６，４５（４）：１９３—１９８．　［１３］　ＷＡＮＧ　ＰＸ，ＹＵ　ＺＣ，ＬＩＢＹ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｅｆｆｉ—　ｃｉｅｎｔ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ—ｂａｓｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１５，１４　（１）：Ｉｌ一２１．　［１４］　ＫＵＲＵＳＵ　Ｙ，ＹＯＳＨＩＭＵＲＡ　Ｓ，ＴＡＮＡＫＡ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔ—　ｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ａ　ｐｓｙｃｈｒ０ｔｒｏｐｈｉｃ　ｄｅｅｐ－ｓｅａ　ｂａｃｔｅ—　ｒｉｕｍ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｐｌａｓ—　ｍｉｄ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，３（２）：９６—９９．　［１５］　ＺＨＡＯ　Ｄ　Ｌ，ＹＵ　Ｚ　Ｃ，ＬＩ　Ｐ　Ｙ，ｅｔ　ａ１｜Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ’０ｎ　ｏｆ　ａ　ｃｒｙｐｔｉｃ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＳＭ４２９　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１１，１０（１）：３０—４１．　［１６］　ＴＵＴＩＮＯ　Ｍ　Ｌ，ＤＵＩＬＩＯ　Ａ，ＰＡＲＲＩＬＬＩ　Ｒ，ｅｔ　ａＩ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ａｎ　Ａｎｔａｒｃｔｉｃ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｓ　ａ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｔ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｅｘｔｒｅｍｏ—　ｐｈｉｌｅｓ，２００１，５（４）：２５７—２６４．　［１７］　ＹＵ　Ｚ　Ｃ，ＺＨＡＯ　Ｄ　Ｌ，ＲＡＮ　Ｌ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｇｅ—　ｎｅｔｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｅｐ・・ｓｅａ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｐｓｅｕｄ—－　ｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＳＭ９９１３［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１４，　ｌ３（１）：１—９．　［１８］　ＧＩＵＩ　ＩＡＮＩ　Ｍ。ＰＡＲＲＩＬＬＩ　Ｅ，ＰＥＺＺＥＬＬＡ　Ｃ，ｅｔ　ａｉ．Ａ　ｈｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｔ—　ａｒｃｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣｌ　２５　［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，８２４：２１９－２３３．　［１９１　ＤＡＳ　Ａ。ＸＩＥ　Ｙ　Ｈ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒｏａｄ—ｈｏｓｔ—ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓ—　ｍｉｄ　ＲＫ２：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅ—　ｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ　ｔｈａｔ　ｃａｎ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅ　ｉｎ　Ａｇｒ０６口ｃ　Ｐ　“　ｔｕｎｅ＿，　一　ｃｉｅｎｓ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２４６（３）：３０９—３１５．　［２Ｏ］　ＤＵＩＬｌＯ　Ａ，ＴＵＴＩＮＯ　Ｍ　Ｌ，ＭＡＲ１ＮＯ　Ｇ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎｔａｒｃｔｉｃ　ｇｒａｍ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ—　ｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，２６７（２６７）：２２５—２３７．　［２１］　ＴＨｏＭＡＳ　Ｃ　Ｍ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ＲＫ２　ａｎｄ　ＲＰ１［Ｊ］．Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８１，５（３）：２７７—２９１．　［２２］　ＳＡＸＥＮＡ　Ｍ，ＡＢＨＹＡＮＫＡＲ　Ｍ，ＢＡＳＴＩＡ　Ｄ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉ’ｎｉ—ｔｉａｔｉ‘ｏｎ　ａｔ　ａ　ｄｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２Ｏ１０，２８５（８）：５７０５—５７１２．　［－２３］　ＢＬＡＴＮＹ　Ｊ　Ｍ，ＢＲＡＵＴＡＳＥＴ　Ｔ，ＷＩＮＴＨＥＲＬＡＲＳＥＮ　Ｈ　Ｃ，ｅｔ　ａＬ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｂｒｏａｄ—　ｈｏｓｔ—ｒａｎｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＲＫ２　ｒｅｐｌｉｃｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ＆ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，　６３（２）：３７Ｏ一３７９．　［２４］　ＫＡＳＴ　Ｐ．ｐＫＳＳ－ａ　ｓｅｃｏｎｄ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｌｏｎｅｓ　ＥＪ］．Ｇｅｎｅ，１９９４，１３８（１／２）：１０９—１１４．　［２５］　ＰＡＰＡ　Ｒ，ＲＩＰＰＡ　Ｖ，ＳＡＮＮＩＡ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｌｄ　ｉｎ—　ｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，　１２７（２）：１９９－２１０．　［２６］　ＰＡＲＲＩＬＬＩ　Ｅ，ＣＵＳＡＮＯ　Ａ　Ｍ，ＧＩＵＬＩＡＮＩ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌｌ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１　２５：　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｅｘｏ—ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２００６，５（１）：１—３．　［２７］　ＰＡＲＲＩＬＬＩ　Ｅ，ＶＩＺＩＯ　Ｄ　Ｄ，ＣＩＲＵＬＬＩ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ＴＡＣ１２５　ｓｔｒａｉｎ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｔ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２００８，７（１）：１－１０．　［２８］　ＳＣＨＡＦＥＲ　Ａ，ＴＡＵＣＨ　Ａ，ＪＡＧＥＲ　Ｗ。ｅｔ　ａ１．Ｓｍａｌｌ　ｍｏｂｉｌｉｚ—　ａｂｌｅ　ｍｕｌｔｉ—－ｐｕｒｐｏｓｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅ——　ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＫ１８　ａｎｄ　ｐＫ１９：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｄｅ—　ｌｅｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｒｎ　［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９４，１４５（１）：６９—７３．　［２９］　ＫＡＣＺＭＡＲＣＺＹＫ　Ａ，ＶＯＲＨ０ＬＴ　Ｊ　Ａ，ＦＲＡＮＣＥＺＣＨＡＲ—　ＬＯＴ　Ａ．Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｓｐｈｉｎ—　ｇｏｍｏｎａｄｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ＆ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２。　７８（１０）：３７７４—３７７７．　［３ｏ］　ＰＨＩＬＩＰＰＥ　Ｎ，ＡＬＣＡＲＡＺ　Ｊ　Ｐ，ＣＯＵＲＳＡＮＧＥ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍ—　ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐＣＶＤ４４２，ａ　ｓｕｉｃｉｄｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ａｌｌｅｌｅ　ｅｘ—　・　１Ｏ６・　发酵科技通讯　第４６卷　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ，Ｊ］．Ｐｌａｓｍｉｄ，２００４，５ｌ（３）：２４６—２５５．　［３１］　王飞雁，张松涛，黄奇洪，等．超嗜热古菌遗传操作系统研究　进展［Ｊ］．微生物学报，２００９，４９（１１）：１４１８—１４２３．　ＣＴ０ＲＩ—　［３２］　ＳＭＩＬＬＩＥ　Ｃ，ＰＩＬＡＲ　ＧＡＲＣＩＬＬＡＮ—ＢＡＲＣＩＡ　Ｍ，ＶＩ＇１３６３　钟卫鸿．基因工程技术Ｉ－Ｍ３．北京：化学工业出版社，２００７．　　ａ１．Ｃｏｕｎｔｅｒｓｅ—　［３７］　ＲＥＹＲＡＴ　Ｊ　Ｍ，ＰＥＬＩＣＩＣ　Ｖ，ＧＩＣＱＵＥＬ　Ｂ，ｅｔｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒｓ：ｕｎｔａｐｐｅｄ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｐａｔｈ０ｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９８，６６（９）：４０１１—　４Ｏ１７．　Ａ　ＦＲＡＮＣＩＡ　Ｍ。ｅｔ　ａ１．Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ１＇Ｊ３．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ—　ｇｙ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｒｅｖｉｅｗｓ　ｍｍｂｒ，２０１０，７４（３）：４３４—　４５２．　，１３８］　高翔．小麦族植物果聚糖合成酶基因克隆及功能验证［Ｄ］．　北京：中国农业科学院，２０１０．　ｓ　ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ　ｄｅ　ｓａｃＢ，ｇｅｎｅ　ｄｅ　ｓｔｒｕｃ－　［３９］　ＳＴＥＩＮＭＥＴＺ　Ｍ．Ａｎａｌｙｓｉｔｕｒｅ　ｄ＇ｕｎｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｅｃｒｅｅｔｅｅ，ｌａ　１ｅｖａｎｅｓａｃｃｈａｒａｓｅ　ｄｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａ１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　，１３３３　ＥＧＡＮ　Ｓ，ＪＡＭＥＳ　Ｓ，ＨＯＬＭＳＴＲＯＭ　Ｃ，ｅｔｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｆｏｕｌｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｕｎｉｃａｔａ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉ—　ｏｌｏｇｙ，２００２，４（８）：４３３—４４２．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｍａｒｂｕｒｇ［Ｊ３．Ｍｏ１．ｇｅｎ．ｇｅｎｅｔ，１９８３，１９１：１３８—１４４．　ｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　，１４ｏ］　ＫＡＳＴ　Ｐ，ＨＥＮＮＥＣＫＥ　Ｈ．Ａｍｉｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ—ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｂｙ　　ａｌ＿Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　，１３４］　ＦＲＡＮＫＳ　Ａ，ＥＧＡＮ　Ｓ，ＨＯＬＭＳＴＲＯＭ　Ｃ，ｅｔｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｕｎｉｃａｔａ　ｐｒｏ—　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂ　ｏｌｏｇｙ，１９９１，　２２２（１）：９９－１２４．　ｒｉｄｅｓ　ａ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ａｐｐｌｉｅｄ＆ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，７２（９）：６０７９—　６０８７．　［４１］　ＣＯＮＧ　Ｌ，ＲＡＮ　Ｆ　Ａ，ＣＯＸ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉ—　ｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ１＇Ｊ３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９　（６１２１）：１９７－２１７．　，１３５］　ＹＵ　Ｚ，ＷＡＮＧ　Ｊ，Ｉ　ＩＮ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｌ－・ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ　Ｐｓｅｕｄ—　。＇１４２３　魏爱英，葛玉萍．Ｌ一赖氨酸的代谢途径到工业生产［ｊ］．发酵　科技通讯，２０１１，４０（２）：３１－３４．　ｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｒｆ－１［Ｊ］．Ｐｌｏｓ　ｏｎｅ，２０１５，１０（３）：　ｅ０１２２７４】．　（责任编辑：朱小惠）　（上接第９１页）　－１６３朱芳莹，董正伟，朱文渊，等．糖尿病治疗药物及其合成进展　［Ｊ］．发酵科技通讯，２０１６，４５（３）：１７５—１８１．　）Ｄ　Ａ，ＳＨ（）ＥＭＡＫＥＲ　Ｒ　Ｈ，ＰＡＵＬＬ　Ｋ　Ｄ，ｅｔ　ａＩ．　［７３　ＳＣＵＤＩＥＲ（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＩＩＩ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｉｎ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ￣Ｊ］．Ｔｈｅ　ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ，１９８３，　１５（１０）：９７７—９８６．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ／ｆｏｒｍａｚａｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｕｓｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　［１１］　朱勃，思扬，窦言东．荧光探针技术在谷胱甘肽检测中的应用　Ｉ－Ｊ３．发酵科技通讯，２０１６（３）：１７０—１７４．　［１２］　ＺＨＡＮＧ　Ｗ　ＺＨＵ　Ｍ，ＷＡＮＧ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｎｏ—ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ　ｔｅｔ—　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ［ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８８。４８（１７）：４８２７—　４８３３．　ｒａｚｏｌｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｂａｓｅｄ　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ＤＷＩＮ　Ｃ　Ｊ，Ｈ０ＬＴ　Ｓ　Ｊ，Ｄ０ＷＮＥＳ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ　［８３　Ｇ０（）ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ａｓｓａｙｓ：ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｎｅｗ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｆｏｒ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ￣Ｊ］．Ａｎａ—　ｌｙｔｉｃａｌ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，５０９：３３—４０．　ｓａｌｔｓ，ＸＴＴ　ａｎｄ　ＭＴＳ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ，　１９９５，１７９（１）：９５－１Ｏ３．　Ｊ　Ｚ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ　ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｂｉｏ—ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｎ—　［１３］　ＺＨＵ　Ｍ，ＦＡＮＧ　ｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｎｏｖｅｌ　ｄｕａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｔｈａｔ　ｄｉｓｒｕｐｔ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｆｕｎｃ—　ＴＭＡＮ　Ｆ　Ｐ．Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｓａｌｔｓ　ａｎｄ　ｆｏｒｍａｚａｎｓ１＇Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　［９］　ＡＩ　ｉｎ　ｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，９（３）：１－５６．　Ｋ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎａｚｉｎｅ　ｍｅｔｈｏｓｕｌｐｈａｔｅ－ｔｅｔｒａｚｏ—　［１ｏ］　ＲＡＡＰ　Ａ　ｌｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ＮＡＤ（Ｐ）　一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｅ一　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍ—　ｉｓｔｒｙ，２０１７，８９（３）：１６８９—１６９６．　（责任编辑：朱小惠）