何首乌多糖分离鉴定与免疫调节活性研究

何首乌多糖分离鉴定与免疫调节活性研究

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根,其性微温,味苦、甘、涩,现代临床上常用于治疗高脂血症、抗衰老、增强机体免疫、抗菌、造血和改善心血管功能等,为川渝地区的道地药材之一。目前,何首乌的活性成分研究主要集中在二苯乙烯苷类,而对何首乌多糖的关注较少,研究何首乌多糖的生物活性,充分挖掘何首乌的药用价值,有利于带动何首乌多糖类药物和保健食品的开发,助推重庆生物医药产业的发展。

为此,本论文对何首乌药材以及水提后药材残渣中多糖组分的免疫调节活性及结构特征展开研究,揭示何首乌多糖免疫调节活性与其结构间的关联性,以具有免疫调节活性的何首乌多糖为药物载体构建具有潜在协同效应的轭合物体系,主要研究结果如下:(1)选用去离子水和稀碱液为提取溶剂,分别从何首乌药材和水提后药材残渣中获取何首乌粗多糖WPMP和APMP。通过离子交换柱层析结合凝胶柱纯化的方式,对两种粗多糖进行分级纯化,得到均一多糖WPMP-1、WPMP-2和APMP-2,采用GPC法测定均一多糖的平均分子量,WPMP-1、WPMP-2和APMP-2的平均分子量分别为2.04kDa、92.13kDa、7.72kDa。

糖醛酸检测显示WPMP-2和APMP-2为酸性多糖,糖醛酸含量分别为16.5%和3.2%。在水提多糖的脱色处理中,根据多糖与色素分子的极性和分子量差异,以具有反相色谱和分子筛双重特性的SBC MCI GEL填料为分离介质,实现了水溶液中多糖组分与其他色素和小分子物质间的快速分离。

与脱色前相比,脱色后多糖含量提高至80%以上,多糖的保留率超过90%。(2)利用红外光谱、HPLC、甲基化-GC-MS分析以及核磁共振分析法对何首乌均一多糖进行结构解析。

结果表明,WPMP-1仅由葡萄糖构成,其主链糖苷键构成为→4)-α-D-Glc-(1→,在O-6

上具有分支点;WPMP-2由鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖组成,以→4)-α-D-GalpA-(1→,和→2)-α-D-Rhap-(1→组成的重复单元为主链,在主链鼠李糖的O-2/4上连接以→5)-α-Araf-(1→组成的阿拉伯聚糖支链或以→4)-β-D-Galp-(1→构成的半乳聚糖支链;APMP-2的单糖组成包含甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖和阿拉伯糖,摩尔比为0.14∶0.44∶0.15∶4.31∶0.24∶1.06∶0.86。在此之前,WPMP-1的糖链结构、WPMP-2的单糖组成及糖链结构和APMP-2的单糖组成尚未见报道。

(3)通过小鼠脾细胞和腹腔巨噬细胞的体外培养,研究何首乌多糖对细胞增殖和免疫功能的影响。结果显示,何首乌多糖不但可以促进正常小鼠脾细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能,高浓度(≥0.3 mg·mL-1)时,何首乌多糖的促进效应显著高于LPS组。

在何首乌多糖与5-FU共培养体系中,何首乌多糖还对5-FU所致的免疫细胞损伤和免疫功能抑制具有良好的调节作用。随着多糖浓度的增加,脾细胞的细胞活力和巨噬细胞的吞噬功能逐渐恢复至接近正常水平,小鼠脾细胞中IL-2和腹腔巨噬细胞中TNF-α的分泌水平显著上升。

其中WPMP-2的调节作用最为显著,当多糖浓度≥0.3 mg·m L-1时,WPMP-2组中脾细胞IL-2的分泌水平(≥1257.9±64.2 ng·L-1)恢复明显,甚至高于正常组(##p<0.01);当多糖浓度≥0.1mg·m L-1,WPMP-2即可使巨噬细胞分泌TNF-α分泌水平恢复并高于正常水平。不同何首乌多糖的免疫调节能力强弱顺序可表示为WPMP-2>WPMP>APMP>APMP-2>WPMP-1。

根据何首乌均一多糖的免疫调节活性强弱关系和多糖分子量及单糖组成、糖醛酸含量、支化程度等结构特性上的差异,分析何首乌多糖免疫调节活性与结构间的关系。结果表明,何首乌多糖免疫调节活性与糖醛酸含量,鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖在单糖组成中的比例,

以及支化程度呈正比的关系。

(4)以何首乌多糖WPMP-2为载体,与5-FU的衍生物5-FUAc通过酯键结合构建何首乌多糖-药物轭合物(WPMP-2@5-FU)。对轭合物的载药量测定、释药特性和生物活性研究结果显示,轭合物体系中小分子5-FUAc的含量为7.79%;5-FUAc从轭合物体系中的释放与pH值相关,在与体内结肠部位相似的pH(pH7.4)环境中,表现为持续稳定的缓释现象。

在肿瘤细胞体外增殖实验中,随着药物作用时间从24h逐渐延长至96h,轭合物对肿瘤细胞HepG-2和HT-29的体外增殖抑制率增加,对HepG-2的体外增殖抑制率从20.20%增加到47.69%,对HT-29的体外增殖抑制率从5.43%增加到51.09%。通过腹腔注射给药,正常小鼠在接受轭合物作用一个月后体重变化、血清中IL-2/TNF-α水平、小鼠脾细胞的增殖能力和腹腔巨噬细胞的吞噬功能均与正常饲养小鼠无显著差异。

结果表明,轭合物WPMP-2@5-FU具有潜在的结肠定位释药特性,轭合物对肿瘤细胞的细胞毒作用随着药物累计释放量的增加而增强,通过将5-FU与何首乌多糖WPMP-2结合形成轭合物,可使5-FU对机体免疫系统造成的毒副作用大大降低。